Геноміка і геномна інженерія Гени нуклеаз у геномній

Геноміка і геномна інженерія. Гени нуклеаз у геномній інженерії Спецкурс Лекція 8

Типи нуклеаз q. Хоумінгові нуклеази q. Нуклеази на основі білків- «цинкових пальців» (zinc finger proteins, ZFP; zinc finger nucleases - ZFN) q. TAL-ефекторні нуклеази (TALEN) Основна тема – уведення розривів у ДНК стимулює рекомбінаційні процеси

Хоумінгові нуклеази (ХО) q I-Sce. I q HO q I-Cre q I-Mso q ……. q Своєрідні мобільні генетичні елементи, розташовано у інтронах або інтеїнах їхні гени q Розпізнають послідовність із 14 -40 п. н. – достатно довга послідовність, щоб бути унікальною у великому геномі q Гідролізують сайт розпізнавання у гомологічному алелі, що не містить гена ХО, і за рахунок гомологічної рекомбінації передаються останньому Утворення двониткового чи (рідше) однониткового розриву у ДНК стимулює рекомбінаційні процеси, що має низку інженерних перспектив щодо організмів, для яких гомологічна рекомбінація між інтактними ДНК іде неефективно

Хоумінгові нуклеази

Хоумінгові нуклеази

Хоумінгові нуклеази

Цинкові пальці q Транскрипційний фактор TFIIIA Xenopus leavis q Новий ДНК-зв’язувальний мотив – близько 30 амінокислот (3 к. Да), спірально-β-складчаста структура з координованим атомом цинку. Назва – цинковий палець (ZFP) Zn

Цинкові пальці q TFIIIA складається з 9 доменів

Цинкові пальці q Гени ZFP кодують найчисельніший клас ДНК зв’язувальних білків у геномах евкаріот

Цинкові пальці Розпізнавання ДНК ZFP – модульна організація Перша модель Поточна модель q Два сусідні ZFP у межах одного білка взаємодіють з двома тетрануклеотидними субсайтами, що перекриваються q Відносно висока автономія окремих ZFP

Конструювання високоспецифічних ZFP q Корисність ZFP полягає у здатності розпізнавати послідовності достатньо довгі, аби бути унікальним у великому геномі евкаріот q Трипальцеві ZFP розпізнають 9 п. н. послідовність – таких послідовностей у геномі людини буде тисячі q 18 п. н. послідовність з високою імовірністю буде унікальною адресою у геномі людини – отже постає завдання створення 6 пальцевих ZFP

Конструювання високоспецифічних ZFP q Дві загальні стратегії - Конструювання індивідуальних ZFP, специфічних до певних триплетів, потім їхнє об’єднання. Це т. зв. модульний дизайн, що має кілька різновидів – бактерійна одно-гібридна система, OPEN тощо МУТАГЕНЕЗ, СЕЛЕКЦІЯ Переваги – простота, недоліки – не враховується перекриття сайтів розпізнавання, зсув фази у взаємодії багатопальцевих ZFP з ДНК. Накопичується напруженість звязування ДНК (binding strain), оскільки ДНК – не ідеальна спіраль (В-форма)

Конструювання високоспецифічних ZFP q Дві загальні стратегії - Конструювання трипальцевих або двопальцевих модулів Стратегія 3 × 2 FP (Sangamo Biosciences) - - Переваги – вища спорідненість до ДНК і специфічність її зв’язування ; 3 × 2 FP - найпопулярніша стратегія на сьогодні. Рівномірніший розпділ напруженості зв’язування, легше конструювати більші ZFP - Недоліки – висока початкова інвестиція у створення 2 FP; кількість усіх можливих 2 FP – 4096.

Використання ZFP q ZFP використовують як ДНК-розпізнавальний і зв’язувальний модуль, до якого приєднують функціональний модуль Модуль розпізнавання ZFP Функціональнй модуль Активація Репресія Модифікація - Корекція - Нокаут - Додавання

Використання ZFP q Конкретніше….

ZFP-TF q Конкретніше – ген checkpoint kinase 2 (СНК 2) Лентивірусний вектор, що містить tet. O-zfp Інфекція клітин

Нуклеази на основі ZFP - ZFN q Функціональний домен у цьому випадку – неспецифічний ендонуклеазний домен ЕР типу ІІS Fok. I q Fok. I каталізує гідроліз ДНК тільки як димер q На цьому засновано стратегію використання ZFN, де два ZFN розпізнають суміжні сайти, а Fok. I каталізує двонитковий розрив ДНК у спейсері (6 п. н. ) між ними

Контроль димеризації ZFN q Слід уникнути гомодимеризації Вихідна організація Облігатна гетеродимеризація Облігатної гетеродимеризації досягають за рахунок уведення мутацій у поверхню димеризації Fok. I

Використання ZFN q ZFN-індукований розрив ДНК вмикає рекомбінаційні процеси q Частоти рекомбінації зростають на 2 -3 порядки! q Можна використати для: Негомологічне з’єднання кінців Гомологічна рекомбінація ДНК

Використання ZFN q Уведення мутації стійкості до ВІЛ у ген CCR 5 (корецептор віруса)

Використання ZFN q Поєднання ZFN, селективного маркера і Piggy. Bac на прикладі генної корекції дефектного гена антитрипсина (веде до цирозу) 4 % - біалельне заміщення!

Клінічні випробування на основі ZFN q http: //www. sangamo. com

Нуклеази на основі TAL-ефекторних білків q Transcription activator-like proteins, виявлено у Xanthomonas

Дизайн TALEN Простіше ніж ZFN?

Використання TALEN

Finita la comedia