Геноміка і геномна інженерія Гени інтеграз як знаряддя

Геноміка і геномна інженерія. Гени інтеграз як знаряддя геномної інженерії Спецкурс Лекція 4

Інтеграція як спосіб стабільної експресії q Ретровіруси - γ-ретровіруси (вірус мишачої лейкемії – MLV) - Лентивіруси (HIV) q Адено-асоційовані віруси (AAV)

Гамма-ретровіруси q γ-ретровіруси (вірус мишачої лейкемії – MLV) - Інтегруються у мітотично активні клітини - Інтегрази належать до родини транспозаз DDE - Для проникнення до геному необхідний розпад ядерної мембрани - Інтегруються “випадково” у ділянки еухроматину Цитоплазма Зворотно-транскрипційний комплекс Преінтеграційний комплекс Ядро

Сайти інтеграції ретровірусів HIV MLV ALV Еухроматин з нуклеосомами і без них

Механізм інтеграції ретровірусів

Як працює ретровірусна система q Пакувальна лінія клітин (ПЛК) – містить вірусні гени, що кодують капсид, і матрикс (Gag, Env) і поліфункціональний білок Pol (зворотна транскриптаза, РНКаза, інтреграза). ПЛК не містить послідовності ψ (псі), тому віріони не формуються q Ретровірусний вектор - ділянка для клонування трансгена, і цис-діючі елементи для пакування ДНК у капсид, зворотної транскрипції, інтеграції. Містить ψ.

Як працює ретровірусна система Містить ДНК і білки – полімеразу, інтегразу

Ретровірусна система – за і проти q Ретровіруси – одні з найнебезпечніших інфекційних агентів -Стабільно утримуються у геномі (інтеграція) + -Багато сайтів інтеграції, часто поблизу онкогенів +/-Сильні промотори + -Висока інфекційність (титр інфекції) + -Гнучкий геном – порівняно висока місткість – розмір трансгена, якй можна клонувати у вектор (приблизно 7, 5 т. п. н. ) + -Природний спосіб проникнення у ядро (на відміну від хімічних методів уведення трансгенів): розпад мембрани для гамма-, і проникнення через пори для лентивірусів +

Ретровіруси у генній терапії q X-зчеплений важкий комбінований імунодефіцит (SCID) - Рецесивний генетичний синдром – брак функціонального гена для рецептора імунної системи IL 2 RG. Навіть за стерильних умов діти живуть у середньому не більше 2 -3 років. Зустрічність – 1/2× 105

Принцип терапії SCID-X 1 q Проста модель – уведення функціонального гена значно змінює виживання пацієнтів

Принцип терапії SCID-X 1 Містить ДНК і білки – полімеразу, інтегразу Автологічні клітини Обробка вірусом ex vivo

Перше випробовування генотерапії SCID-X 1 q Cavazzana-Calvo et al. , 2000 q 9 пацієнтів – у всіх була ремісія SCID-X 1 після терапії q Між 31 і 68 місяцями після терапії у 4 -х пацієнтів розвинулась лейкемія; 3 з них досягли стану ремісії лейкемії після хіміотерапії q Причина лейкемії – вірусний вектор інтегрувався у промоторні ділянки прото-онкогенів LMO 2, BM 11, CCND 2; виявлено також делеції супресорів онкогенів, хромосомні перебудови q У трьох випадках сайт інтеграції віруса – ідентичний. Карго (трансген) або особливості будови вектора впливають на характер інтеграції?

Інші випробовування генотерапії SCID-X 1 q Schwarzwaelder K. et al. , 2007; Hacein-Bey-Abina et al. , 2002 q 10 пацієнтів – у всіх була ремісія SCID-X 1 після терапії q В іншому випробуванні – 4 з 5 видужали q Після останнього тесту (31 місяць після терапії) – нема ознак лімфопроліферативних захворювань q Новий вектор у випробовуванні на 10 пацієнтах q Останні дослідження свідчать про вплив послідовностей вектора на специфічність інтеграції

Вектори для SCID-X 1 q Відмінності в організації Не містить маркера q Псевдотипування – пакування мишачих чи “гуманізованих” векторів у капсид, що містить білки специфічні для вірусів приматів. Такі вектори викликають знижену імунну відповідь

Лентивірусні вектори q Основна особливість – проникають у ядро через пори, не потребують розпаду ядерної мембрани, тому можуть інфікувати мітотично неактивні клітини (напр. нерви) q HIV

Лентивірусні вектори q Основна особливість – проникають у ядро через пори, не потребують розпаду ядерної мембрани, тому можуть інфікувати мітотично неактивні клітини (напр. нерви). Місткість – 8 – 10 т. п. н. q HIV

Генотерапія СНІДу через ас. РНК

Вектори на основі адено-асоційованого вірусу q Інфікують як сплячі, так і мітотично активні клітини. Низька імуногенність q Сайт-специфічна інтеграція в унікальний локус 19 хромосоми людини – AAVS 1. Складний механізм інтеграції – інтеграза+білки реплікації+? ? ? q Особливий цикл розвитку – латентна фаза і реплікативна, остання потребує хелпера – аденовіруса q Місткість – до 4 т. п. н. q Складно створювати

Генотерапія на основі AAV q Терапія in vivo певних видів вродженої сліпоти

Генотерапія на основі вірусних векторів q Станом на 2011 р – 5000 пацієнтів пойшли курс генотерапії на основі вірусних векторів, успіх перемінний q Весь спектр хворіб розглядаються як об’єкт терапії – вірусні (СНІД), рак, моногенні дефекти q Безліч модельних експериментів (на мишках, лініях клітин, собаках, приматах) q Корекція генних дефектів функціональної копії гена за рахунок інтеграції q Експресія антисенс-РНК – терапія СНІДу q Висока експресія трансгена/ас-РНК q Високий титр трансдукції проникнення у ядро – природні шляхи

Генотерапія на основі вірусних векторів q Імуногенність вірусних векторів – білки капсиду і сама ДНК викликають імунну відповідь. Особливо характерно для ретровірусів, не характерно для AAV - псевдотипування, циклічна зміна серотипів векторів q Генотоксичність вірусних векторів – випадкова інтеграція у геном може викликати індукцію експресії онкогенів. Генотоксичність з точки зору геномної інженерії - це результат геномних перебудов чи зміни експресії генів клітин господаря під впливом чужорідної генетичної конструкції, що врешті-решт веде до патології/смерті - Слід ретельно досліджувати вектори і тестувати їх на різних моделях; видаляти усі зайві послідовності, що можуть мати небажану промоторну активність q Низька місткість – розбивка гена на частини, інтеїни

Сайт-специфічні інтегрази прокаріотів q IntφС 31 - належить до родини резольваз-інвертаз, походить із помірного актиноміцетного фага C 31. Не потребує інших кофакторів для активності q Опосередковує рекомбінацію тільки між гетеротиповими сайтами att. B у хромосомі (34 п. н. ) та на фазі/плазміді - att. P (39 п. н. ) із використанням залишку серину в активному центрі білка q Продукти рекомбіназної реакції – att. L та att. R – нездатні вступати у гомологічну чи Phi. C 31 -залежну рекомбінації, що робить реакцію односторонньою та незворотньою за відсутності білка-фактора напряму рекомбінації (RDF) q Сайти інтеграції C 31 виявлено у багатьох організмів

Сайт-специфічні інтегрази прокаріотів

Int phi. C 31 в інженерії ссавців q 19 псевдо-att. B сайтів – “гарячих точок” рекомбінації – 56 % усіх інтеграцій q Ще 12, що використовуються часто. Разом – 31 Ще багато рідкісних псевдосайтів – у сумі близько 370 q Стовбурові клітини зазнають ремоделювання хроматину і мають свій тип інтеграції

Int phi. C 31 в інженерії ссавців Інтеграція у псевдосайти Конструювання платформи

Int phi. C 31 в інженерії ссавців q Інтеграції у псевдосайти – неточні – на кінцях сайтів делеції або інсерції послідовностей вектора чи геному. Реакція att. B × att. P – завжди точна q Описано випадки геномних перебудов, індукованих інтегразою при рекомбінації між псевдо-аtt. P q Контроль активності інтегрази у часі і просторі

Int phi. C 31 в інженерії ссавців Підвищення специфічності інтегрази допомогою спрямованої еволюції за

Int phi. C 31 в інженерії ссавців Підвищення специфічності інтегрази допомогою спрямованої еволюції за

Int phi. C 31 в інженерії ссавців Мінікільця – для епісомальної експресії Видалення послідовностей вектора покращує експресію трансгенів

Int phi. C 31 для створення моделей хвороб У мишки добре іде гомологічна рекомбінація Сайт “приземлення”

Різні інтегрази, різні організми q http: //flyc 31. frontiers-in-genetics. org/ - Використання φС 31 у генетиці дрозофіли q Рослини Сайт “приземлення” Хелперна плазміда q Інші інтегрази: BT 1, lambda, R тощо Ядерна локалізація

Фагові інтегрази + + Джерело інтегрази – плазміда, м. РНК, очищений білок (ін’єкція) + + Інтеграція Делеція Інсерція ВМ рекомбінація Заміщення

Фагові інтегрази – одним поглядом q Інструменти для одонокерункового введення змін у геном q Не потребують білкових кофакторів господаря q Phi. C 31 інтегрується у псевдо-att. P сайти багатьох організмів. Їх використовують для уведення змін q Інший варіант – створення платформ, або сайтів “приземлення” – у певну ділянку хромосоми інтегрують нативний att. P, який далі використовують q Проблеми – сайтів інтеграції у деяких організмів багато (в людини – 31/370); інтеграза може викликати небажані перебудови у геномі; імуногенність білка-інтегрази q Шляхи вирішення – еволюція специфічних інтеграз, жорсткий контроль їньої активності, уведення білка чи м. РНК, а не самого гена інтегрази