ГЕНОМ ПРО- И ЭУКАРИОТ Регуляторные последовательности Новосибирск 2012
Регуляторные последовательности и их роль Базальный промотор β-талассемия TATA box, CACCC box, DCE β-глобина Проксимальны Синдром Бернарай промотор Сулье Мутация в +133 в 5’ области гена Gp. Ibβ Энхансер Мутации на расстоянии 1 Mb в направлении 5’ от гена SHH Преаксиальная полидактилия Сайленсер Мышечная дистрофия Делеция D 4 Z 4 повторов гены 4 q 35 ЛКР α-талассемия Делеция в 62 п. о. в 5’ области кластера α-глобинов Инсулятор Синдром Видемана. Беквита Сайт связывания CTCF гена H 19/Igf Генетические заболевания связанные с нарушениями в регуляторной области генов
Регуляторные последовательности По расположению относительно старта транскрипции: 5’-концевые регуляторные последовательности 3’-концевые регуляторные последовательности Энхансеры, сайленсеры и инсуляторы…
Регуляторные последовательности Эукариоты Прокариоты: проксимальные элементы (промотор, оператор) дистальные элементы терминаторы Структура и функционирование прокариотического оперона. Структура и функционирование эукариотического гена.
Прокариоты – регуляторные элементы Промотор - это регуляторная последовательность, предшествующая кодирующей части гена, которую узнает фермент РНК-полимераза. Основной элемент промотора - место связывания РНК-полимеразы, которое она занимает перед началом синтеза РНК. В состав промоторов могут входить также участки связывания белков-регуляторов. Присутствует как у прокариот, так и у эукариот. Оператор – это регуляторная последовательность связывания белка– репрессора. Если репрессор присоединен к оператору, то РНК-полимераза не может двигаться вдоль молекулы ДНК и синтезировать м. РНК.
Прокариоты – базальный промотор Кодирующая цепь Сайт старта транскприпции Промотор – 35 послед-ть – 10 послед-ть 5¢ T TG AC A A AC T G T T AT ATAT TA +1 3¢ A T 3¢ 5¢ A 5¢ RNA 3¢ Транскрипция
Прокариоты – базальный промотор Большинство базальных промоторов содержат -35 и -10 элементы, но существуют дополнительно UP элемент и промоторы которые c удлиненным -10 элементом. Консенсусная последовательность базального промотора в зависимости от типа сигма-фактора у E. coli
Прокариоты – базальный промотор lac operon +1 Transcribed – 35 region – 10 region TTTACA N 17 TATGTT N 6 A lac. I GCGCAA N 17 CATGAT N 7 A trp operon TTGACA N 17 TTAACT N 7 A rrn. X TTGTCT N 16 TAATAT N 7 A rec. A TTGATA N 16 TATAAT N 7 A lex. A TTCCAA N 17 TATACT N 6 A t. RNAtyr TTTACA N 16 TATGAT N 7 A Consensus TTGACA TATAAT
Прокариоты – UP элемент – АТ богатый район, представленный в сильных промоторах. Элемент взаимодействует с С – концевым доменом РНК полимеразы. Промоторы можно разделить на две группы: Конститутивные – промоторы генов, которые транскрибируются постоянно (р. РНК, рибосомальных белков, РНК полимераз) Индуцируемые – промоторы генов, транскрибируемые при определенных условиях, на определенной стадии. Именно они подвергаются регуляции с различных регуляторных элементов.
Прокариоты - регуляция промоторов Различают несколько типов регуляции у бактерий: В первую очередь – позитивный и негативный контроль. При позитивном контроле транскрипция оперона включается, при негативном – выключается. Ключевым регулирующим элементом при данном типе регуляции является оператор. В отличие от промотора, оператор представляет собой уникальную последовательность для связывания либо с белком-активатором (позитивная регуляция), либо с белком-супрессором (негативная регуляция). Оператор arg оперона E. coli, известный так же как ‘arg Regulon’. Аргинин действует как ко-супрессор и связывается с белком-супрессором Arg. R. Подавление транскрипции сильно зависит от концентрации аргинина в клетке.
Прокариоты - регуляция промоторов Негативный контроль на примере lac оперона
Прокариоты - регуляция промоторов Позитивный контроль на примере lac оперона
Прокариоты - регуляция промоторов Комплексная регуляция lac оперона
Прокариоты - регуляция промоторов Регуляторные последовательности lac оперона
Прокариоты – дистальные элементы Энхансер (ген-усилитель) – короткий сегмент ДНК, который влияет на уровень проявления (экспрессии) определённых генов, увеличивая частоту инициации и транскрипции. Энхансер-зависимая инициация транскрипции у прокариот. Энхансер-зависимые промоторы прокариот отличаются по составу последовательности от классических.
Прокариоты – дистальные элементы Энхансер-зависимая регуляция транскрипции – довольно распространенное явление в царстве прокариот.
Прокариоты – терминаторы Классические терминаторы - содержат GC-богатый участок, обладающий центральной симметрией, вслед за которым располагается последовательность нуклеотидов, состоящая из выстроенных подряд четырех-восьми остатков A, в матричной цепи ДНК. Rho -независимая терминация Эффективность терминации транскрипции на таком терминаторе зависит от стабильности терминаторной шпильки РНК
Прокариоты – терминаторы rho utilization site Rho protein is a helicase r-зависимая терминация
Прокариоты – терминаторы
Прокариоты – терминаторы (аттенюация) Аттенюация на примере trp оперона
Эукариоты – регуляторные элементы Цис - регуляторные элементы (cis-regulatory elements) - участки ДНК расположенные в непосредственной близости от структурной части гена, способные связываются с регуляторными молекулами и регулировать экспрессию гена. Цис - регуляторные ДНК элементы в составе генов, транскрибируемых РНК полимеразой II
Эукариоты – базальный промотор Базальный промотор – короткая последовательность ДНК, необходимая для РНК-полимераза II-зависимой транскрипции. Коровый промотор имеет длину ~ 35 -40 п. о. и содержит определенные ДНК мотивы: • TATA box • Инициаторный элемент Initiator element (Inr) • Регуляторный элемент, располагающийся ниже старта транскрипции (Downstream core promoter element) • Downstream Promoter Element (DPE) • TFIIB распознающий элемент (BRE) • Motif Ten Element (MTE) TATA box Базальный промотор для РНК-полимеразы II или TATA-box.
Эукариоты – базальный промотор Виды базальных промоторов: • Инициаторный элемент (Initiator element (Inr)) • TFIIB распознающий элемент (BRE) • Регуляторный элемент, располагающийся ниже старта транскрипции (Downstream core promoter element (DCE)) • Motif Ten Element (MTE) • Downstream Promoter Element (DPE) Базальные промоторные элементы Maston et al. , 2006
Эукариоты – базальный промотор У Drosophila melanogaster существует большая группа промоторов РНКполимеразы II, не содержащих ТАТА бокса. Было замечено, что для осуществления транскрипции с таких промоторов необходима область от +1 до +40 от старта инициации транскрипции. Она была названа DPE (Downstream Promoter Element). Консенсусная последовательность DPE промоторов; наиболее важен нуклеотид G в положении +24 (вне области DPE консенсуса). Для работы DPE промотора критично наличие интактного инициаторного элемента (Inr). Burke and Kadonaga, 2012
Эукариоты – «другие» базальные промоторы т. РНК, 5 S РНК и 7 SL РНК гены транскрибируются при помощи РНК-полимеразы III, промотор которой значительно отличается от промотора РНК-полимеразы II. В отличие от промоторов РНК-полимеразы II, промоторы РНК-полиеразы III – внутренние, то есть находятся в составе кодирующей части гена и транскрибируются. Существуют и другие варианты промоторов…
Эукариоты –проксимальные элементы Проксимальный промотор – регуляторный район, расположенный непосредственно перед коровым промотором и содержащий множество сайтов связывания с активаторами. Cp. G островки – регуляторные последовательности, имеющие длину от 500 до 2000 п. о. (не менее 200 п. о. ) и GC состав более 50%. Регуляция транскрипции через метилированные Cp. G островки Схема регуляции взаимодействия энхансера с коровым промотором с помощью проксимального промоторного элемента у Drosophila Calhoun et al. , 2002; Fuks et al. , 2003
Эукариоты – дистальные элементы, энхансеры Энхансер, «промоторы для промоторов» - специфическая регуляторная последовательность ДНК, расположенная удаленно от базального промотора гена - мишени и осуществляющая функцию активации транскрипции через связывание различных транскрипционных факторов. Особенности энхансеров • Энхансеры представляют собой тесно сгруппированные кластеры сайтов связывания транскрипционных факторов • Пространственная организация и ориентация сайтов транскрипционных факторов в составе энхансера оказывает влияние на регуляторную активность • Функция не зависит от расстояния между энхансером и промотором регулируемого гена • Функция не зависит от ориентации энхансера относительно промотора регулируемого гена
Эукариоты – дистальные элементы, энхансеры Теневые энхансеры - shadow enhancer/s Having two copies of the same thing is good, but the adaptive advantage of such duplication may only be apparent under specific, perturbing conditions. Spemann and Waddington Генетическая избыточность Иллюстрация защитной функции теневых промоторов Hobert et al. , 2010
Эукариоты –энхансеры Энхансеры и активация транскрипции Пример Классическая модель активации транскрипции генов Альтернативная модель сборки ПИК Szutorisz et al. , 2005
Эукариоты – дистальные элементы, энхансеры Некоторые энхансеры ортологичных или гомологичных генов позвоночных – весьма консервативные последовательности, что позволяет проводить их поиск у разных организмов. Вариабельность одного из энхасеров, регулирующих экспрессию генов развития позвоночных.
Эукариоты – дистальные элементы, сайленсеры Сайленсер - специфическая регуляторная последовательность ДНК, расположенная удаленно от базального промотора гена - мишени и осуществляющая функцию репрессии транскрипции через связывание различных транскрипционных факторов. Особенности сайленсеров • Сайленсеры содержат сайты связывания репрессоров • Регуляторная активность не зависит от расстояния между сайленсером и промотором регулируемого гена • Функция не зависит от ориентации сайленсера относительно промотора регулируемого гена • Существуют сайленсеры для которых функция зависит от позиции
Эукариоты – дистальные элементы, инсуляторы Инсуляторы - особые регуляторные элементы, которые обладают способностью блокировать сигналы исходящие от окружения Домен экспрессии гена (Gene expression domain) – геномная последовательность, содержащая сам ген и все цис - элементы необходимые для достижения уровня и тайминга экспресии соответствующего паттерну in vivo Свойства инсуляторов • Инсулятор имеют длину от 0. 5 до 3 тысяч п. о. • Регуляторная активность инсуляторов зависит от позиции и не зависит от их ориентации • Инсуляторы могут блокировать взаимодействие между энхансером и промотором, если находится между ними. • Инсуляторы могут предотвращать распространение репрессионного хроматина Capelson and Corces, 2005
Эукариоты – дистальные элементы, инсуляторы Механизмы регуляторной активности инсуляторов Активность инсуляторов регулируется при помощи РНК-интерференции. (А) Два инсулятора связаны друг с другом при помощи инсулятор-связывающих белков. (В) Специальный белок Rm 62 связывает как инсулятор-белковый комплекс, так и двухцепочечную РНК, что приводит к разрушению комплекса двух инсуляторов. Capelson and Corces, 2005
Эукариоты – дистальные элементы, ЛКР Локус – контролирующий район – группа регуляторных элементов, участвующих в регуляции локуса или кластера генов Свойства ЛКР • ЛКР как правило состоят из большого количества цис - элементов: энхансеров, сайленсеров, инсуляторов, MARs или SARs (участки ассоциированные с матриксом). • С цис – элементами ЛКР связываются различные транскрипционные факторы, коактиваторы, репрессоры, и/или модификаторы хроматина. • Регуляторная активность инсуляторов не зависит от позиции и зависит от их ориентации относительно контролируемого локуса
Эукариоты – дистальные элементы, ЛКР Механизм действия локус – контролирующего района Петлевая модель (Looping model) Организация локуса глобинов человека Liang et al. , 2008
Спасибо за внимание
Прокариоты DNA Shine-Delgarno Stop Codon +1 box ATG TAA, TAG, TGA Cis-Regulatory Coding Sequence= ORF Elements USE/Promoter /Operator Protein A 5’ UTR = Leader sequence ATG Coding Sequence= ORF Protein B Spacer = 5’UTR of 2 nd cistron Cistron 1 Cistron 2 5’ UTR = Leader sequence Polycistronic m. RNA терминатор Spacer ORF Protein A +1 AUG Shine-Delgarno box AUG Stop Codon Shine-Delgarno UAA, UAG, UGA box ORF Protein B Stop Codon UAA, UAG, UGA
RNA Polymerases • Differences between eukaryotes & prokaryotes • Prokaryotes – 1 enzyme with 4 subunits • 2 α’s, 1 , & 1 ’ • actual polymerase function – Sigma factors (σ ) • recognize & bind promoter DNA sequence • Eukaryotes – 3 separate holoenzymes – each has ~12 subunits • RNA Pol I – 28 S, 18 S, 5. 8 S r. RNA • RNA Pol II – m. RNA, sn. RNA • RNA Pol III – t. RNA, 5 S r. RNA – 3 sets of basal transcription factors • recognize promoter DNA sequences
Prokaryotic Transcription Initiation Figure 12. 6
Rho Independent Termination in Prokaryotes • r-independent termination requires two sequences in the RNA – A stem-loop structure upstream of 7 -9 U residues Nus. A Stabilizes the RNA pol pausing Figure 12. 9 r-independent termination
Прокариоты - регуляция промоторов Регуляция trp оперона
Эукариоты: 5’-регуляторные участки эукариот по своему составу уникальны для каждого гена, однако, имеют общую структуру – промотор, проксимальные элементы и дистальные элементы. Общая схема организации регуляторных последовательностей эукариот. (a) Пример простейшей организации – присутствует коровая промоторная последовательность TATА-box, UAS – активаторная последовательность, и сайленсер. (b) Пример сложной организации – помимо проксимальных регуляторных последовательностей (коровый промотор и проксимальные промоторные элементы) присутствуют также дистальные элементы – энхансеры и инсуляторы; инициаторная последовательность или инициаторный элемент – INR, внутренние промоторные элементы – DPE, и энхансерные элементы в 3’ области.
Эукариоты – «другие» базальные промоторы • RNA Pol I – r. RNA precursor • RNA Pol II – m. RNAs, U 6 sn. RNA • RNA Pol III – t. RNA, 5 S r. RNA, U 1 -U 5 sn. RNAs Pol I UBF SL 1 UCE Core 45 S r. RNA precursor Pol II GSTFs TFIID UAS TATA box Pol III pre-m. RNA TFIIIB TFIIIC AB t. RNA precursor
Скачать презентацию ГЕНОМ ПРО- И ЭУКАРИОТ Регуляторные последовательности Новосибирск 2012
lecture9_regulatory seq.ppt