Геном человека Сваровская Мария Геннадьевна, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории эволюционной генетики НИИ медицинской генетики СО РАМН
Геном - вся совокупность генетического материала организма, гаплоидный набор хромосом (1920 г. Ганс Винклер) Геном - вся совокупность генетического материала организма, полный набор инструкций, необходимых для его построения и функционирования. Основная функция генома – информационная геном генотип Совокупность генов данного организма, которая характеризует вид в целом Совокупность генов данного организма, которая характеризует особь . Размер генома человека – примерно 3, 3 млрд пар оснований.
Различия между двумя людьми на уровне ДНК: 1 нуклеотид на 1000. Уровень разнообразия геномов определяется: § разнообразием геномов прародителей данного вида § скоростью накопления мутаций – "ошибок", возникающих при переписывании клеткой генетических текстов § возрастом вида
Физическим носителем генетической информации является ДНК. § Молекула ДНК + связанные с ней белки = хромосома § Ядро каждой клетки человека кроме гамет и зрелых эритроцитов содержит 23 пары хромосом – по одной отцовской и материнской хромосоме в каждой паре.
Парадокс С 1978 год Т. Кавалье-Смит феномен значительной избыточности генома эукриот в отношении некодирующих последовательностей нуклеотидов
Генетическая информация у всех клеток закодирована в виде последовательности нуклеотидов в ДНК. Основания: аденин, гуанин – пурины цитозин, тимин, урацил – пиримидины
Митохондриальный геном 13 генов, кодирующих белки 22 гена транспортных РНК
Хромосома М § Кольцевая молекула 16569 п. о. § Не связана с белками. § Очень высокая «плотность генов» : отсутствуют интроны, межгенные промежутки очень невелики. § 13 генов, кодирующих белки и 22 гена транспортных РНК. § Очень большая копийность. Каждая митохондрия имеет от 2 до 10 копий мт. ДНК. § Несколько кодонов имеют иной смысл (напр. кодон UGA в митохондриях не является терминирующим, а транслируется как триптофан). § Синтез ДНК, РНК и процессинг РНК в митохондриях кодируется ядерными генами. § мт. ДНК мутирует в 10 -20 раз чаще, чем ядерная. Причины – меньшая точность репликации и репарации мт. ДНК, наличие в митохондриях реактивных кислородных частиц. § Материнское наследование болезней, вызванных мутациями в мт. ДНК § Митохондриальные болезни: миоклоническая эпилепсия, глухота, зрительная нейропатия Лебера, синдром Кирнса-Сейра, диабет, наступающий в зрелом возрасте.
Ген- участок молекулы ДНК, который занимает на хромосоме строго определённую позицию и последовательность ДНК которого содержит информацию, необходимую для синтеза белка Ген -функциональная единица генома. Размер– от нескольких сотен до нескольких млн пар оснований. Кодирующие белок последовательности (экзоны) 3 -10% генома, Некодирующие участки (интроны) - от 90% Ген – фрагмент ДНК, кодирующий белок, выполняющий структурную или регуляторную функцию, являющийся ферментом, катализирующим определенную метаболическую реакцию в клетке, или рецептором, или играющим иную роль в жизнедеятельности клетки или организма. ген состоит из двух основных функциональных частей (последовательностей нуклеотидов) – регуляторной и структурной. Геном человека - 30 -35 тыс. генов Кодирующая часть гена начинается с метионинового кодона -АУГ ТАТА-бокс. 25 -30 нуклеотидов “выше” (с 5 -конца) сайта инициации транскрипции СААТ-бокс расположена в районе 70 -80 нуклеотидов от сайта инициации транскрипции. Регуляторные элементы. Энхансеры, сайленсеры аттенюаторы Транскрипционные факторы – регуляторные белки, осуществляющие высокоспецифические белокбелковые и белокнуклеиновые взаимодействия.
Спейсеры -некодирующие районы между генами § Тандемно повторяющиеся (в виде блока повторов) - альфоидные повторы у человека (171 н. п. ) - сателлитная ДНК: STR (1 -6 н. п. ) и VNTR( 7 -50 н. п. ) § Диспергированные по геному - Alu-повторы (300 н. п. ) - Ретротранспозоны: SINE ( 90 -400 н. п. ) и LINE (до 7000 н. п. ) - Псевдогены (ДНК-копии м. РНК)
Реализация генетической информации
Транскрипция - процесс синтеза РНК на матрице ДНК. Продукт синтеза РНК - первичный транскрипт. (Подвергается различным модификациям). Точка начала транскрипции - нуклеотид в ДНК, соответствующий первому нуклеотиду в РНК. Стадии транскрипции: 1. Инициация (распознавания матрицы и собственно инициации). 2. Элонгация 3. Терминация Распознавание матрицы: присоединение РНК-полимеразы к промотору, локальная денатурация в районе присоединения энзима. Собственно инициация транскрипции - синтез первых нескольких нуклеотидов (примерно 9) (РНКполимераза остается присоединенной к промотору, не продвигаясь вдоль ДНК). Элонгация - дальнейший синтез РНК, связанный с продвижением РНК-полимеразы вдоль матрицы и постоянным продвижением участка локальной денатурации. Терминация распознавание точки (терминирующей последовательности), после которой не следует присоединять нуклеотиды к нити РНК. Коллапс участка локальной денатурации, отсоединение энзима и молекулы РНК.
Процессинг (модификация первичного РНК -транскрипта) : - создание кэп-сайта - сплайсинг Кроме обычного, существует альтернативный сплайсинг
Трансляция - процесс синтеза белка на специализированных клеточных органеллах – рибосомах 1. Инициация (принимают участие м. РНК, рибосомы, белки-факторы инициации - IF 1, IF 2 и IF 3). 2. Элонгация (отсоединение факторов инициации и присоединение второй субъединицы рибосомы) 3. Терминация (сигналом служит один из стоп-кодонов).
Феномены, усложняющие концепцию гена: § § Интронные гены (Ген находится внутри интрона другого гена) Гены с перекрывающимися рамками считывания (Один участок ДНК может кодировать два разных § § Существование энхансеров, сайленсеров, аттенюаторов (Отдаленные регуляторные элементы ) Мобильные элементы (От поколения к поколению генетические элементы обнаруживаются в различных § Перестановка генов (Перестановка ДНК или сплайсинг на уровне ДНК в соматических клетках приводит к § Варианты копийности (Число копий генов или регуляторных элементов может различаться между § Эпигенетические модификации, импринтинг ( Экспрессия одной из двух копий гена зависит от того, от § Эффект структуры хроматина (Структура хроматина влияет на экспрессию генов, при этом она свободно связана с § Альтернативный сплайсинг РНК (С одного транскрипта могут получаться несколько м. РНК, кодирующих § Продукты альтернативного сплайсинга с альтернативными рамками считывания (Два § Транс-сплайсинг РНК, гомотипичный транс-сплайсинг (Белок может быть синтезирован по м. РНК, § § Редактирование РНК (РНК подвергается ферментативным модификациям ) Белковый сплайсинг, вирусные полипротеины (Белки могут саморасщипляться (автопротеолиз) на § Белковый транс-сплайсинг (Разные белки могут быть сплайсированы друг с другом даже в отсутствии транс- § Белковые модификации (Для того, чтобы белок стал функциональным, ему необходимо пройти ряд § § Ретрогены (Образуется путём обратной транскрипции по м. РНК с последующей вставкой ДНКого продукта в геном. ) Транскрибируемые псевдогены (Биохимическая активность предположительно «мёртвых» элементов. ) белка в двух рамках считывания ) участках генома ) образованию альтернативных продуктов. индивидуумами ) кого она унаследована – от отца или от матери) определёнными последовательностями ДНК ) разные белки) продукта альтернативного сплайсинга одной пре-м. РНК кодируют два белка без общих последовательностей. скомбинированной из нескольких транскриптов ) несколько функциональных продуктов ) сплайсированных транскриптов ) модификаций после трансляции )
Генетический код -триплетный -не перекрывающийся -вырожденный (существуют синонимы) -универсальный (кроме митохондрий, которые эволюционировали долгое время независимо, существует очень мало исключений)
Отклонения от универсальности генетического кода
Human Genom Project Геном человека 1989 -2000 Конечная цель-построение генетической карты с разрешением 2 Мб -полное секвенирование генома человека • Число генов (сократилось от 80 -100 тыс до 30 -40 тыс) • Обнаружен перенос генов «по горизонтали» (свыше 200 генов в геноме человека, заимствованных у бактерий) • Геном человека - «молекулярное кладбище» (95% занимают повторы разных типов, псевдогены, молекулярные останки вирусов, перемещающиеся геномные элементы и т. д. )
Практическое приложение результатов программы «Геном человека» § Лечение генетических заболеваний § Идентификация новых генов и выявление среди них тех, которые обусловливают предрасположенность к тем или иным заболеваниям (возникновение фармакогенетики) § Фармакогенетика – выяснение генетически обусловленных особенностей индивидуальной реакции организма на различные фармпрепараты. Идентификация личности (геномная дактилоскопия) § Этногеномика § Палеогеномика
Карты генетического сцепления Показывают относительное расположение на хромосоме генов и других маркеров. Строят на основе анализа данных по наследованию гена или маркера в ряду поколений. Требования к маркеру: -по нему должны наблюдаются межиндивидуальные различия -эти различия легко выявляются -маркер должен быть полиморфным 1 с. М равна примерно физической дистанции в 1 млн п. о. (или 1 Мб). Если расстояние между маркерами равно 1 с. М, то это значит, что частота рекомбинаций между этими маркерами равна 1%. Геномная база данных (Genome Data Base GDB) объединяет всю информацию, касающуюся исследований генома человека: • фрагменты человеческого генома (гены, клоны, ПЦР-маркеры, цитогенетические маркеры, fragile sites, контиги и повторы) • карты человеческого генома (цитогенетические карты, карты связывания, радиационные гибридные карты и др. ) • вариации в геноме (мутации и полиморфизм)
Физическое картирование Мелкомасштабные (хромосомная и к. ДНК Гибридизация – процесс образования д. ц. молекулы из двух комплиментарных цепей ДНК или цепи ДНК и цепи РНК. • Клонированная копия гена помечается меткой. Этот фрагмент ДНК наз. зонд • Инкубация с метафазным препаратом хромосомы. • Происходит связывание зонда с о. ц. ДНК-мишенью на интактной хромосоме по принципу комплиментарности. • Установление точной локализации метки (в микроскоп) Крупномасштабные (Макрорестрикционная и карта контиг) Клонирование (амплификация in vivo) – размножение фрагментов в составе рекомбинантных молекул ДНК в клетках чужеродного хозяина. Последовательность нуклеотидов - самая подробная из физических карт. Секвенирование – процесс выявления последовательности нуклеотидов ДНК. Включает следующие этапы: - субклонирование фрагментов ДНК из космид или библиотеки бактериофагов в специальные векторы для секвенирования, которые несут небольшие части клонированных фрагментов - преобразование субклонированных фрагментов в набор молекул ДНК, различающихся по длине только на один нуклеотид. Высокоразрешающие методы электрофореза (напр. использование метода Сэнгера) позволяют разделить этот набор фрагментов и считать последовательность оснований.
Мутации Хромосомные Геномные: (перестройки) полиплоидия: - нехватки - дефишенси гетероплоидия или анеуплоидия - удвоение- дупликация (моносомия, трисомия, полисомия), - поворот на 180 – инверсия - перемещение участка на негомологичную транслокация Генные: -замена пары оснований, -вставка (сдвиг рамки считывания), -выпадение (сдвиг рамки считывания),
Типы полиморфизма ДНК: -Точечные мутации –замены отдельных нуклеотидов. -Инсерции или делеции небольших фрагментов -Минисаттелитные повторы. (вариабельность по числу тандемных повторов (variable number of tandem repeats locus VNTR) Размер повторяющегося элемента – от 10 до 100 нуклеотидов. -Микросаттелитные повторы (вариабельность по числу коротких тандемных повторов (short tandem repeats STR). Размер повторяющегося элемента - 2, 3, 4, 5 или 6 нуклеотидов. -По наличию или отсутствию мобильных генетических элементов ( Alu, псевдогены - негативные, но стабильные элементы генома, возникшие в результате мутаций в ранее работающем гене).
Мутации трансляции: Мутации транскрипции: -в инициирующем кодоне (ATG) или вблизи него. -мутации в области промотора. -мутации сдвига рамки считывания (в результате делеции или инсерции) -мутации сплайсинга РНК, в том числе мутация в 5 - донорном сайте интрона, мутация в 3 -акцепторном сайте интрона и мутации, приводящие к возникновению новых сайтов сплайсинга. -миссенс-мутация – замена одного аминокислотного остатка в молекуле белка на другой. Могут приводить к нарушению экспрессии гена, поскольку новая структура РНК или белка может оказаться нестабильной. -мутации расщипления м. РНК (мутации полиаденилирования) -нонсенс-мутации (стоп-мутации) мутирование кодона в терминирующий. Приводит к образованию укороченного белка. -мутации кэп-сайта -делеции активирующих районов или энхансеров -мутации в терминирующих кодонах (TAA, TAG, TGA). Приводят к синтезу белковых продуктов длиннее нормальных.
Базы данных. • GDB • Online Mendelian Inheritance in Man Datebase • Geg Bank • Genom Sequence Data Base (GSDB) • European Molecular Biology Laboratory (EMBL) • Nucleotide Sequence Database • DNA Data Bank of Japan (DDBJ).
Принцип и применение ПЦР Для осуществления реакции необходимы: Анализируемая ДНК олигонуклеотидные праймеры, комплиментарные фланкирующим последовательностям анализируемого участка ДНК: прямой (F-forward и R-revers). Тaq-полимераза. . Четыре дезоксирибонуклеотидтрифосфата d. NTP: d. ATP, d. TTP, d. GTP, d. CTP. Буфер, содержащий магния, сульфат аммония и добавки, влияющие на кинетику процесса или на темп. плавления ДНК. Консольвенты (Tween-20, DMSO, FA –формамид) Процесс: 90 -95 град. С –денатурация. 50 -65 град. С - отжиг (гибридизация) прймеров на специфичных праймерам последовательностях матрицы 72 град. - ферментативный синтез цепи ДНК – достраивание праймера, начиная с 3’-конца, присоединением d. NTP
Схема ПЦР
Скачать презентацию Геном человека Сваровская Мария Геннадьевна кандидат биологических наук
М.Г.Сваровская. Геном человека ppt.ppt