ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА и НАСЛЕДСТВЕННЫЕ БОЛЕЗНИ II. Этиология, Профилактика Диагностика Лекция № 3
План лекции 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Этиология наследственных болезней Генетический груз Величина генетического груза Мутации, классификация Полимеразная цепная реакция Молек. диагностика хромосомных болезней Новые методы исследования генома
ЭТИОЛОГИЯ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ Все наследственные болезни- результат мутаций, т. е. изменений в структуре ДНК, исключение –эпигенетические болезни – устойчивые, часто зависящие от пола, функциональные изменения ДНК. Мутации могут быть: § спонтанные § индуцированные § эпигенетические (эпимутации) Мутации могут : § передаваться гаметами § возникать в соматических клетках эмбриона
Генетический груз (ГГ) – наследственная изменчивость в популяции, приводящая к появлению менее приспособленных особей, подлежащих естественному отбору - Мутационный груз - 1 мутация на 10 гамет 6 - Сегрегационный груз - из поколения в поколение - Субституционный груз - эффект при изменении условий среды §
Величина генетического груза §Летальность 70% всех зигот человека § Новорожденные с НБ и врожденными пороками 5 -5, 5% § Пороки развития новорожденных 2, 5% § Наследственные болезни 1, 5% Хромосомные - 0, 5% Генные - 1, 0% § Болезни с выраженной наследственной предрасположенностью (дети до 5 лет) 3 -3, 5% § Всего известно НБ - более 4 000 § Доля 15 наиболее частых НБ до 5 лет > 50% § Число бесплодных супружеских пар 10 -15% § Ежегодно в России рождается 100 000 детей - инвалидов §В Петербурге число детей- инвалидов в 2010 г 14 625
Классификация мутаций I. ГЕНОМНЫЕ § Диплоидный набор 2 n=46 § Гаплоидный 1 n=23 § Полиплоидия (триплоидия 3 n=69; тетраплоидия 4 n=92) § Анеуплоидия (трисомия 2 n=47; моносомия 2 n=45 II. ХРОМОСОМНЫЕ (делеции, дупликации, инсерции инверсии, транслокации) III ГЕННЫЕ § Точечные (сайтовые) мутации (нейтральные –SNP, нонсенс, миссенс § Внутригенные перестройки (делеции, дупликации, инверсии, инсерции) § Динамические мутации § Перемещение мобильных элементов (Alu -300 -500 п. о. х 100 000; Line - 6 500 п. о. х 50 000)
Патогенез наследственных болезней (НБ) I. Хромосомные болезни – дисбаланс 1000 генов одной хромосомы или её фрагментов § Избыток генетического материала (трисомия) менее драматичен, чем его отсутствие (моносомия) § Нарушения функции генома на уровне ДНК (дисбаланс структурных и регуляторных генов, микро - РНК), на уровне ядра (нарушения микроархитектоники ядра, локализации гетерохроматина, хромосомных территорий, пр. ) - «клеточный синдром» , неспецифические и специфические фенотипические проявления II, Генные болезни- дефекты одного гена: природа гена (гены –господа/ гены –рабы) функция гена (место в генной сети), тип мутации ( плюс /минус -эффекты; доминантные/ рецессивные), первичный биохимический дефект
Уровни патогенеза НБ I. Молекулярный: первичный биохимический дефект § Отсутствие, недостаток или избыток генопродукта § Неправильный по структуре генопродукт, § Нарушения регуляторных взаимодействий между генами и целыми генными сетями II. Клеточный уровень: § Нарушения метаболизма клетки, функций мембранных рецепторов, энергетики клетки, межклеточных взаимодействий: (Болезни накопления - лизосомные болезни, мукополисахаридозы) III. Тканевой и органный уровни § Первичная и вторичная гетерогенность (плейотропия) наследственных болезней
Диагностика хромосомных болезней Цитогенетическая диагностика. Этапы : : Приготовление метафазных пластинок Окраска препаратов Кариотипирование хромосомных препаратов Специальные методы: Гибридизация in situ: варианты FISH, ДНК-зонды, Метод CGH (Comparative Genome Hybridization) Молекулярная диагностика хромосомных болезней
Кариотипирование с использованием компьютерных программ
FISH с хромосомспецифическими ДНКпробами на “прямых” препаратах из хориона/плаценты WCP-7 WCP-4 D 18 Z 1 DXZ 1 45, X 47, ХY, +mar 47, XX, +i(18 p) 46, XY, t(4; 15)
НОВОЕ В ЦИТОГЕНЕТИКЕ Прогресс любой науки – прогресс методов 1. Стирание грани между молекулярными и цитогенетическими исследованиями; доступны анализу любые мутации: геномные, хромосомные, генные, 2. Цитогенетическое картирование - совмещение хромосомных и геномных карт, стало возможным благодаря выполнению программы Гаплоидный геном ( Hap. Map) -насыщение генома миллионами молекулярных маркеров ( SNP- карта гаплоидного генома)
МЕТОДЫ НА СТЫКЕ ГЕНЕТИКИ И ЦИТОГЕНЕТИКИ 1. MAPH – Multiplex Amplifiable Probe Hybridization Мультиплексная Гибридизация с амплифицированными зондами 2. MLPA –Multiplex Ligation -dependent Probe Amplification Мультиплексная Лигаза - опосредованная Амплификация Зондов 3. CGH - Comparative Genome Hybridization - Сравнительная Геномная Гибридизация – 4. Array CGH - Биочиповая Сравнительная Геномная Гибридизация 5. SKY – Spectral Karyotyping –Спектральное кариотипирование МЕТОДЫ 1, 2 - м направленного поиска микроперестроек хромосом; МЕТОДЫ 3, 4, 5, – геномного скрининга вариаций числа копий – CNV Сopy Number Variations - протяженные (1 Kb - 40 Mb) дупликации, делеции составляют основу геномного полиморфизма (ГП) , которые в 10 раз увеличивают генетическое разнообразие Homo sapiens
Coverage/plexing Методы детекции структурных хромосомных аберраций Bo. Bs Conventional karyotyping Microarray based methods QF-PCR FISH, QF-PCR and MLPA Resolution
СРАВНЕНИЕ НОВЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ ТЕХНОЛОГИЯ ВРЕМЯ МАТЕРИАЛ ДИАГНОСТИКА ОЦЕНКА РЕ-ТОВ ЦЕНА КАРИОТИП 6 -10 дн Клетки MLPA 2 -3 дн 10 n. G QF-PCR 1 -2 дн 2 n. G STR, aneup. el. phoresis 40 $$ FISH 23 ч. Клетки 3/slide микроскоп 350 $$ Array CGH 48 ч. 500 n. G-6 µG тысячи сканирование BACson. Beads 24 ч. 50 -250 n. G Весь геном 40 -50 100 миккроскоп секвенирование Luminex скан. 20 $$ 500 $$ 100 $$
КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ФЛЮОРЕСЦЕНТНАЯ ПЦР – QF-PCR Ø Метод используют для пренатальной диагностики (ПД) частых хромосомных болезней таких как болезнь Дауна (Ts 21), синдром Патау (Ts 13), синдром Эдвардса ( Ts 18), синдром трипло -Х ( Ts. Х), триплоидии ( 3 n= 69). на долю которых приходится до 95% всех хромосомных болезней Ø Анализ поводится на амниоцитах, а при необходимости на любых биоптатах плода ( хорион, плацента, кровь) Ø Метод уже широко внедрен в службу ПД многих стран Западной Европы и Америки, но в России не применяется Ø Рассматривается в качестве удобного скрининирущего теста частых хромосомных болезней у плода Ø Основан на количественном анализе тандемных высокополиморфных ДНК маркеров, идентификация которых позволяет точно определять число хромосом у плода
QF-PCR в пренатальной диагностике хромосомных болезней 3 5 3 3 5 дисомия 1: 1 трисомия 2: 1 ABI Prism 3100 -Avant 3 4 5 трисомия 1: 1: 1 3 3 Отсутствие информативности <3 , 4. , 5 - число ATTG повторов в локусе ABI-3100 Prism Avant
Пример детекции трисомии 18 (синдром Эдвардса) D 21 S 11 1: 1 D 18 S 391 2: 1 D 21 S 1270 1: 1 D 18 S 386 1: 1: 1 Неинформативный маркер
Сравнительная геномная гибридизация (CGH) на хромосомах (I) и на планшетах -CGH-array (II) для диагностики хромосомных болезней , связанных м микрохромосомными перестройками I Выявление микроделеций и микродупликаций II Локализация микроделеций и микродупликаций на хромосомах
Молекулярное кариотипирование с помощью сферических биочипов Диагностика • анеуплоидий по 5 хромосомам (21, 13, 18, X, Y) • 9 микроделеционных синдромов
ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ВОЗМОЖНОСТИ assay Bo. Bs™ Aneuploidy for chrom. 13, 18, 21, X and Y Microdeletion syndromes Общая частота 1: 1 500 1. Di. George 2. Williams-Beuren. 3. Prader-Willi 4. Angelman 5. Smith-Magenis 6. Wolf-Hirschhorn 7. Cri du Chat 8. Langer-Giedion 9. Мiller-Dieker
ГЕНОМНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ перестройки генома, вызванные протяженными (1 - 50 Мб) дупликациями или делециями (CNV - Copy Number Variation), стали доступными для анализа после появлением новых технологий : MLPA, CGH, array-CGH, GWAS Ø CNV встречаются в 100 - 10 000 раз чаще, чем сайтовые мутации (SNP), в 10 раз увеличивают межиндивидуальные генетические различия( от 99, 9% по SNP до 99, 0% - при CNV + SNP). У каждого человека в среднем 500 -700 CNV на геном Всего известно более 11 000 CNV Ø важен для понимания эволюции генома, т. к. является источником новых экзонов, новых генов с новыми функциями, меняют архитектонику ядра, влияют на программу индивидуального развития , гипотеза «геномного кода» Ø могут быть причиной Геномных Болезней – болезней нарушения архитектоники ядра, концептуально близкие «хроматиновым» болезням и болезням «импринтинга» . ØСоздана база данных субмикроскопических находок и геномных болезней - DECIPHER Ø
ГЕНОМНЫЕ БОЛЕЗНИ Ø включают частые комплексные (МФЗ), МВПР, синдромы микроделеций, задержку умственного развития, аутизм шизофрению, болезнь Крона, др. МФЗ и пр. перспективны для разгадки «черной материи генома» , скрывающей основные гены комплексных болезней (2011) Ø патогенетическую основу ГБ составляет варьирование числа повторов низкой частоты (LCR) и больших фрагментов ДНК (CNV), содержащих структурные гены Ø механизмы возникновения ГБ: неаллельная гомологичная рекомбинация (NAHR) между LCR (1) и возникающие при репликации разрывы-слияния микрогомологичных районов хромосом (2), Ø связаны с перестройками генома, его нестабильностью, но не с изменениями ДНК-сиквенса (точковыми мутациями) Ø современные технологии позволяют улавливать CNV в 1 000 раз меньше, чем разрешение светового микроскопа и в 10 раз меньше, чем доступно методом FISH
Делеция 4. 61 Мб 8 р23. 2 -р23. 1 и CGH профили больного, его матери и брата CNV-array Делеция включает ген микроцефалии MCDH 1 и ген CSMD Вариабельность фенотипических проявлений 2/3 CN V делеции возникает de novo 2/3 CNV дупликаций наследуется 2/3 de novo CNV - Соотношение CNV делеций и дупликаций 2: 1 Barber J. C. K ECA NL 2008, 22, P. 6 -15
Диагностика генных болезней § Объектом исследования является молекула ДНК § ДНК-диагностика возможна на любой стадии онтогенеза § Два варианта ДНК-диагностики: - прямая – детекция мутаций - непрямая – идентификация ДНК-маркера, сцепленного с мутацией или с мутантным геном ПРИНЦИПЫ ДНК-ДИАГНОСТИКИ § Комплементарность пар оснований § Разделение цепей ДНК при нагревании - денатурация § Объединение комплементарных цепей при охлаждении – ренатурация § Наличие специфических эндонуклеаз § Разделение ДНК-фрагментов электрофорезом в гелях § Полимеразная цепная реакция - ПЦР Для каждой НБ характерен свой тип мутаций, свой алгоритм ДНК-диагностики
Методы детекции мутаций I. Поиск неизвестных мутаций § конформационный полиморфизм одноцепочечных фрагментов -SSCP § электрофорез в денатурирующем гралиентом геле DGGE § химическое расщепление некомлементарных сайтов. CMC § анализ гетеродуплексов -HA § прямое секвенирование -DS II. Идентификация известных мутаций § § § Блот - гибридизация по Саузерну (1975) Полимеразная цепная реакция -ПЦР (1985) Диагностика с помощью биочипов ( 2 000)
ОСНОВНЫЕ ТИПЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ § Прямая диагностика - детекция мутаций в гене Преимущества - 100% точность Недостатки - необходимость точных данных о мажорных мутациях или «горячих» точках гена §Косвенная диагностика - детекция молекулярных. маркеров внутри или рядом с геном Преимущества - универсальность Недостатки -обязательное наличие больного
Базовые методы идентификации мутаций. Метод блот-гибридизации пресс электрофорез в агарозном геле перенос рестрикция ДНК на фильтр слой фильтровальной бумаги фиксирующий ДНК фильтр агарозный гель денатурирующий раствор фиксация ДНК на фильтре гибридизация Метод ПЦР фрагмент ДНК денатурация и отжиг праймеров Синтез ДНК фильтр с фиксированной ДНК гибридизационный раствор с меченым ДНК зондом радиоавтограв отмывка фильтров , высушивание , авторадиография 20 -30 циклов электрофорез
ПРЕНАТАЛЬНАЯ ДАГНОСТИКА ФЕНИЛКЕТОНУРИИ (НЕПРЯМОЙ МЕТОД ) ПДРФ АНАЛИЗА ПРЕНАТАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА МУКОВИСЦИДОЗА (ПРЯМОЙ МЕТОД) МУТАЦИЯ del. F 508
МУЛЬТИПЛЕКСНАЯ ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ОБРАЗЦОВ ДНК БОЛЬНЫХ МИОДИСТРОФИЕЙ ДЮШЕННА.
Whole Genome Analysis Techniques § Array. CGH (D/R) § Whole genome sequencing (R) § Fast genome sequencing (R) § End to end paired-end sequencing (R)
ПРОБЛЕМА МАССОВОГО ГЕНЕТИЧЕСКОГО ТЕСТИРОВАНИЯ НАСЛЕДСТВЕННОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ЧАСТЫМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ МОЖЕТ БЫТЬ РЕШЕНА С ПОМОЩЬЮ НАНОТЕХНОЛОГИИ ДНК- БИОЧИПОВ Ø ДНК-биочипы - упорядоченные матрицы гелиевых ячеек на предметном стекле, каждая из которых содержит молекулярный ДНК зонд для идентификации определенной мутацию или полиморфизма ØДНК-биочипы позволяют автоматизировать ДНК диагностику наследственных болезней, определять индивидуальную наследственную предрасположенность к частым мультифакториальным заболеваниям, чувствительность к лекарственным препаратам и т. д. )
Технология микробиочипов Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН, Москва
Определение дозы гена SMN 2 методом мультиплексной ПЦР в реальном времени SMN 2 3 копии 2 копии 1 копия β-глобин
МЕТОД ОБЩЕГЕНОМНОГО СКРИНИНГА АЛЛЕЛЬНЫХ АССОЦИАЦИЙ – GWAS (Genome wide association studies) Общегеномный скрининг (технология= Affimetr Chips + Hap. Map with 6 x 10 6 SNP) для выяснения ДНК локусов, сцепленных с заболевание Идентификация генов – кандидатов и анализ ассоциации конкретного ДНК- полиморфизма (SNP) с болезнью
Общегеномный скрининг в системе Hap. Map по поиску генов, ассоциированных с сахарным диабетом типа 1 и 2
Whole Genome Analysis Techniques § Array. CGH (D/R) § Whole genome sequencing (R) § Fast genome sequencing (R) § End to end paired-end sequencing (R)
Whole Genome Analysis • Fast genome sequencing (3 rd generation high throughput) - Whole genome in 15 minutes!!!! -160 patients per run - Very expensive at the moment - Large ‘reads’ 400 bps length for the whole genome - Fragment isolation/parallel sequencing - No clonal amplification
Whole Genome Analysis • Whole genome sequencing • Ist Generation – 1 MB/day - targeted approach but slow • 2 nd Generation – ↑ capacity - Fragmentation, - Isolate fragments - Clonally amplify - Parallel sequencing - Targeted approach
Whole Genome Analysis • End to end paired-end sequencing Fragment DNA Select particular size fragment Sequence the two ends Map ‘end reads’ back to the reference genome Detects: Deletion, duplication, complex Inversions Balanced rearrangements ! Use in conjunction with simple ‘reading’ Still in experimental stage. Needs refinement and validation.
Выводы 1. Генетический груз – доля наследственно ущербных геномов, подлежащих селекции 2. Мутации : геномные, хромосомные, генные, эпигенетические 3. Хромосомные болезни – цитогенетические методы, молекулярно-цитогенетические методы ( FISH, CGH- array) 4. Диагностика генных болезней – прямой и косвенный методs, ПЦР, SSCP, RT-PCR, чиповые методы диагностики 5. Стирание границ между молекулярными и цитогенетическими методами 6. Глубокое параллельное секвенированиеуниверсальный анализ генома
Скачать презентацию ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА и НАСЛЕДСТВЕННЫЕ БОЛЕЗНИ II Этиология Профилактика
Лекция 3 Геном мутации, метолы 2808 11.ppt