Генная инженерия Лекторы Смирнов Иван Витальевич Белогуров Алексей

Генная инженерия Лекторы: Смирнов Иван Витальевич Белогуров Алексей Анатольевич

План курса лекций «Генная инженерия» 1 лекция: Основы генной инженерии. Понятие вектора. Получение генетического материала. Полимеразная цепная реакция. Создание генетических конструкций. Эндонуклеазы рестрикции и другие ДНК-модифицирующие ферменты. Методы внедрения генетических конструкций в клетку-рецепиент. Штаммы клетокреципиентов используемые в генной инженерии. 2 лекция: Продукция рекомбинантных белков в бактериях. Основные системы векторов, BAC-искусственные хромосомы. Регуляторные последовательности. Промоторы и требования к ним. Слитые белки. Тэги для выделения и иммобилизации белков. Способы детекции рекомбинантных белков. 3 лекция: Продукция белков в клетках дрожжей. Челночные векторы, YACискусственные хромосомы. Исследование белок-белковых взаимодействий с помощью двугибридной системы. Направленный мутагенез с помощью ПЦР. 4 лекция: Экспрессия рекомбинантных белков в клетках млекопитающих. Промоторы и способы их регуляции. Ретровирусные векторы. 5 лекция: Векторы на основе фага , космид, фагмид. Библиотеки генов и к. ДНК. Полимеразная цепная реакция. SELEX. Affymetrix. КОНТРОЛЬНАЯ РАБОТА

Ген - молекулы ДНК или РНК, в которых заключена генетическая информация о структуре отдельных белков и нуклеиновых кислот организма Любой ген состоит из двух основных функциональных частей (последовательностей нуклеотидов) – регуляторной и структурной. Геном – совокупность всей ДНК гаплоидного набора хромосом, внехромосомных генетических элементов и органелл клетки зародышевой линии биологического вида

Что такое «генная инженерия» ? Генная инженерия – раздел молекулярной генетики, занимающийся разработкой искусственных генетических систем с использованием манипуляций генами на молекулярном уровне Конечная цель – создание жизнеспособного организма de novo по плану, разработанному в лаборатории

Генная инженерия в современной жизни Фундаментальные исследования Исследование структуры геномов и индивидуальных генов, выяснение их функций. Получение экспрессии рекомбинантных генов в новом генетическом окружении – трансгенез. Направленный мутагенез и белковая инженерия. Медицина Диагностика Генотерапия ДНК-вакцины Рекомбинантные терапевтические препараты

Рекомбинантная биотехнология • Перенос организма единиц в наследственности другой методами (генов) из одного генной инженерии (технология рекомбинантных ДНК) • Целью такого переноса является создание нового продукта или получение уже известного в промышленных масштабах.

Рекомбинантные белки с объемом продаж более 500 миллионов $ в год Наименование продукта Объем продаж Начало продаж, год (млн $) 1. Генно-инженерный инсулин 2. Гормон роста человека 3. Интерферон α 4. Эритропоэтин 5. ГКСФ 6. Фактор крови VIII 7. Интерферон β 8. Глюкоцереброзидаза 9. Фолликулостимулирующий гормон 10. Фактор крови VIIα 5340 1760 2700 8800 2520 670 2200 740 1000 630 1982 (США) 1985 (США) 1986 (США) 1989 (США) 1991 (США+ЕС) 1992 (США) 1993 (США) 1994 (США) 1995 (США) 1996 (ЕС)

Объем продаж рекомбинантных препаратов превышает 700 млрд. долларов

Генная инженерия в лаборатории Создание организма с заданными свойствами (генно-инженерное клонирование) Использование созданного организма (экспрессия рекомбинантного продукта)

Генно-инженерное клонирование

Векторы Задача – интегрировать молекулу-переносчик, исследуемые которая могла фрагменты бы ДНК в автономно существовать внутри бактериальных или эукариотических клеток в виде одной или нескольких копий и передаваться вместе со встроенным в нее фрагментом ДНК от одной клетки к другой. Вектор – самореплицирующая молекула ДНК, используемая в генной инженерии для переноса генов от организма-донора в организм-реципиент, а также для клонирования нуклеотидных последовательностей.

Векторы – молекулярно-генетические конструкции, предназначенные для переноса генетического материала в клетки живых организмов Требования к векторам 1) вектор должен длительное время существовать в популяции клеток-хозяев, т. е. реплицироваться автономно или вместе с хромосомами клеток. 2) в любом векторе должны быть биохимические или генетические маркеры, которые позволяли бы обнаруживать его присутствие в клетках. 3) структура векторной молекулы должна допускать встраивание в нее чужеродной последовательности нуклеотидов без нарушения ее функциональной целостности.

Схематичное изображение вектора p. BR 322

Типы векторов Бактериальные плазмиды (лекция 2) Космиды - небольшие плазмиды, в которые in vitro введены cosсайты ДНК фага . (лекция 5) Фагмиды - векторные молекулы ДНК, которые содержат в себе генетические элементы плазмид и хромосом бактериофагов. (лекция 5) Хромосома фага λ (лекция 5) Искусственные хромосомы BAC (bacterial artificial chromosome) (лекция 2) PAC (P 1 phage-derived artificial chromosome) (лекция 5) YAC (yeast artificial chromosome) (лекция 3) MAC (mammalian artificial chromosomes) (лекция 4)

Емкости векторов разных классов Вектор Емкость (т. п. н. ) Применение Плазмиды 15 Бактериофаг лямбда 25 Библиотеки к. ДНК Геномные библиотеки Библиотеки к. ДНК Космиды 30 -45 Геномные библиотеки PAC 70 -90 То же BAC 100 -500 То же YAC 250 -2000 То же MAC >2000 Генотерапия

Генно-инженерное клонирование

Полимеразная цепная реакция как инструмент современной генной инженерии

Основные факты Кари Б. Муллис (Kary B. Mullis) – изобретатель полимеразной цепной реакции (ПЦР), 1983 год Патент - 1985 г. , фирма Cetus Corp. California Нобелевская премия по химии – 1993 г. Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в условиях in vitro.

Полимеразная цепная реакция: 1 -й цикл

Полимеразная цепная реакция: 2 -ой цикл

Изменение температуры в типичном трехступенчатом цикле ПЦР

Полный температурный профиль полимеразной цепной реакции (25 циклов) a – начальная денатурация ДНК b – собственно реакция с – достройка цепей ДНК d – хранение 4°С

Типичный результат амплификации ДНК с помощью ПЦР - Ген константного региона с интроном мышиного антитела Ig. G 1 - Размер продукта – 762 п. о. - 25 циклов ПЦР - Электрофорез в 1% агарозном геле - Окраска бромистым этидием

Компоненты, необходимые для проведения ПЦР - Объем пробы – 0, 5 -50 мкл - Анализируемая ДНК – 50 -100 нмоль, 0, 1 -0, 25 мкг (до 1 молекулы в пробе) - Термостабильная ДНК-полимераза - 4 Дезоксирибонуклеозидтрифосфата (4 d. NTPs – d. ATP, d. GTP, TTP, d. CTP) – 0, 2 м. М - Олигонуклеотидные праймеры – длина 17 -25 н. т. (0, 5 -1, 0 мк. М) - Ионы Mg 2+ - 0, 5 -3, 0 мк. М - Буферный раствор

Критические характеристики ПЦР, наиболее важные для исследователя - Специфичность - Точность синтеза ДНК - Эффективность

Критические характеристики ПЦР: специфичность - В неоптимальных условиях при амплификации образуются неспецифические продукты ПЦР (шмер, дополнительные полосы) - Электрофорез в полиакриламидном геле, окраска бромистым этидием

Hot. Start ПЦР Vendor 1 – химически модифицированная Taq-полимераза Vendor 2, 3 – Taq-полимераза с температуро-зависимым ингибитором D - Dream. Taq DNA Polymerase (Fermentas), HS Taq ДНКполимераза (Evrogen), Go. Taq® Hot Start Polymerase – Taqполимераза с блокирующим антителом T - Taq ДНК-полимераза - Обратимая инактивация Taq-ДНК-полимеразы резко увеличивает специфичность ПЦР - Добавление в реакционную смесь некоторых соединений (DMSO, бетаин, 2 пирролидон) приводят к тому же эффекту

Точность синтеза ДНК некоторыми термостабильными ДНК-полимеразами

Три стратегии синтеза к. ДНК обратной транскриптазой Случайный праймер Олиго(d. T)-праймер Специфический праймер

Синтез дц-к. ДНК обратной транскриптазой от вируса мышиного лейкоза Молони (M-MLV RT) Evrogen. ru

Эндонуклеазы рестрикции класса II (рестриктазы) – основной инструмент генной инженерии Узнают специфические последовательности – сайты рестрикции Активны в виде димеров в присутствии ионов Mg 2+ Hae. I, Hae. III – Haemophilus aegipticus, открыты в указанной последовательности Hinc и Hind – Haemophilus influenzae, штаммы c и d

Субстратная специфичность рестриктаз класса II Палиндромные сайты мелкощепящие: Hae. I (GGCC), крупнощепящие: Eco. RI (GAATTC), Not. I (GCGGCCGC) Частично вырожденные сайты Hinc. II (GTYRAC, Y = p. Yrimidine, R = pu. Rine), Разорванные сайты Bgl. I (GCCN 5 GGC, N = a. Ny) Квазисимметричные сайты Btr. I (CAC↓GTC, класс IIQ) Двойные сайты: Sfi. I (GGCCN 5 GGCC) Разрезание со смещением - класс IIS (Foc. I GGATGN 9, 13 Shifted cleavage) Последовательности липких концов уникальны Изменение субстратной специфичности в неоптимальных условиях Eco. RI - GAATTC, Eco. RI* - AATT (Mg 2+ , органические растворители)

Изомеры рестриктаз Изошизомеры Рестриктазы разных семейств бактерий, узнающие одинаковые сайты рестрикции и одинаково их расщепляющие. Метилчувствительные рестриктазы: Hpa. II и Msp. I (CCGG) – первый не расщепляет ДНК, если хотя бы один из остатков C метилирован; N-метилирование остатков A – Sau 3 A (и GATC и GMe. ATC), Dpn. I (только GMe. ATC), Mbo. I (только GATC) Гетерошизомеры Узнают одинаковые сайты рестрикции, но по-разному их расщепляют (Kpn. I - G↓GTACC, Asp 7181 - GGTAC↓C)

Формы разрывов ДНК, образующихся под действием рестриктаз класса II «Тупые» концы 5’-выступающие 3’-выступающие

Особенности применения эндонуклеаз рестрикции II класса Bam. HI | Bgl. II nn. GGATCTnn nn. CCTAGAnn Bam. HI nn. G GATCCnn nn. CCTAG Gnn Bgl. II / Bam. HI nn. GGATCCnn nn. CCTAGGnn Bam. HI / Bcl. I nn. GGATCAnn nn. CCTAGTnn Bgl. II nn. A GATCTnn nn. TCTAG Ann Bcl. I / Bam. HI nn. TGATCCnn nn. ACTAGGnn Bgl. II / Bcl. I nn. AGATCAnn nn. TCTAGTnn Bcl. I nn. T GATCAnn nn. ACTAG Tnn Bcl. I / Bgl. II nn. TGATCTnn nn. ACTAGAnn

Особенности применения эндонуклеаз рестрикции II класса Bam. HI Hind. III

Особенности применения эндонуклеаз рестрикции II класса Bam. HI Cla. I

Два способа «затупления» липких концов ДНК Заполнение ДНК-полимеразой Удаление 3’->5’-экзонуклеазой или S 1 -нуклеазой

ДНК-полимераза I E. coli (109 к. Да) обладает тремя активностями: полимеризующей в направлении 5’ 3’, 5’ 3’-экзонуклеазной и 3’ 5’-экзонуклеазной. Фрагмент Кленова) (76 к. Да) имеет две активности: полимеризующей в направлении 5’ 3’и 3’ 5’-экзонуклеазной.

Механизм действия T 4 -ДНК-лигазы Образование фосфодиэфирной связи между 3’-OH- и 5’-фосфатной группами одноцепочечных ДНК Лигирование фрагментов ДНК по «тупым» концам

Побочные продукты лигирования вектора и вставки Кольцевые мономеры Линейные ди-, три-, … мультимеры Кольцевые димеры Рекомбинантная плазмида

Щелочная фосфатаза и полинуклеотидкиназа Щелочная фосфатаза: Оптимальные значения p. H - щелочные Удаление 5’-фосфатных групп (дефосфорилирование) из ДНК, РНК и нуклеотидов Фосфатаза кишечника телят (calf intestinal phosphatase - CIAP). Термолабильна Полинуклеотидкиназа бактериофага T 4: Перенос γ-фосфатной группы ATP на 5’-OH-группу фрагментов ДНК (фосфорилирование). Введение радиоактивной метки, подготовка к лигированию

Предотвращение образования плазмидного вектора без вставки с помощью щелочной фосфатазы 5’ 5’ 5’ Лигирование, трансформация

Терминальная трансфераза в синтезе гомополимеров и клонировании

Создание новых сайтов рестрикции на концах клонируемых молекул ДНК. Линкеры «Тупое» лигирование Обработка Eco. RI «Липкое» лигирование

Создание новых сайтов рестрикции на концах клонируемых молекул ДНК. Адаптеры «Тупое» лигирование Фосфорилирование «Липкое» лигирование

Способы введения ДНК в бактериальные клетки Трансформация – 107 - 108 колоний/мкг ДНК Тепловой шок, введение катионов рубидия, гексаминкобальтхлорида, выращивание при повышенном содержании ионов магния. Электропорация – 109 - 1010 колоний/мкг ДНК шок электрическим полем высокой напряженности (3 -5 мс), поляризация мембран, обратимое повреждение. Трансфекция вирусными частицами Липофекция Микроинъекции

Организмы - хозяева • Бактерии – E. coli • Дрожжи • Трансгенные растения • Молоко трансгенных животных • Культуры клеток млекопитающих

Сравнение различных рекомбинантных систем • Продуктивность • Скорость роста • Размер рекомбинантного белка • Посттрансляционные модификации • Стоимость культивирования • Масштабируемость

Продуктивность Природные E. coli Различная, обычно очень низкая 100 – 1000 мг/л Дрожжи 200 – 15000 мг/л Трансгенные растения 1 мг/гр Молоко трансгенных животных Культуры клеток млекопитающих 20 г/л 50 – 1000 мг/л

Скорость роста Природные - E. coli 6 - 24 часа Дрожжи 5 - 15 дней Трансгенные растения 1 - 3 месяца Молоко трансгенных животных Культуры клеток млекопитающих 4 - 8 часов, рост животного 1 - 3 года 15 - 60 дней

Размер рекомбинантного белка Природные любой E. coli < 50 к. Да Дрожжи < 100 к. Да Трансгенные растения Молоко трансгенных животных Культуры клеток млекопитающих любой

Посттрансляционные модификации Природные все E. coli фосфорилирование Дрожжи фосфорилирование, гликозилирование все Трансгенные растения Молоко трансгенных животных Культуры клеток млекопитающих все

Возможность присутствия вирусов Природные E. coli Дрожжи Трансгенные растения Молоко трансгенных животных Культуры клеток млекопитающих + + +

Стоимость культивирования Природные 1500 $ /л (плазма крови) E. coli 0, 5 $ /л Дрожжи 1 $ /л Трансгенные растения Стоимость проекта > 1 млн. $ Стоимость продукции 1 $ /кг Стоимость молока 0, 5 $ /л Стоимость животного > 1 млн. $ 15 $ /л Молоко трансгенных животных Культуры клеток млекопитающих

Масштабируемость Природные нет E. coli крупнотоннажное Дрожжи крупнотоннажное Трансгенные растения Молоко трансгенных животных Культуры клеток млекопитающих произвольное нет 10 000 литров

2 лекция: Продукция рекомбинантных белков в бактериях. Основные системы векторов, BACискусственные хромосомы. Регуляторные последовательности. Промоторы и требования к ним. Слитые белки. Тэги для выделения и иммобилизации белков. Способы детекции рекомбинантных белков.