Генная инженерия бактерий высших растений и области ее

Генная инженерия бактерий, высших растений и области ее применения 1. Нуклеиновые кислоты и факторы наследственности у животных организмов. 2. Генная инженерия бактерий. 3. Генная инженерия растений. 4. Получение трансгенных растений. 5. Получение трансгенных животных.

• Нуклеиновые кислоты состоят из моносахаридов (рибозы и дезоксирибозы) и пуриновых (аденин, гуанин) и пиримидиновых (цитозин, урацил, тимин) азотистых оснований. • В состав рибонуклеиновой кислоты входит рибоза, аденин, гуанин, цитозин, ура цил, дезоксирибонуклеиновой дезоксирибоза, аденин, гуанин, цитозин, тимин.

• Нуклеиновые кислоты состоят из компонентов, называемых нуклеотидами. • Каж дый нуклеотид содержит моносахариды, фосфорную кисло ту. азотистое основание, • Нуклеотиды образуют полинуклеотидную цепь. • Нуклеиновые кислоты двухцепочечные. (ДНК) могут быть одно и • ДНК, за редким исключением, двухцепочечные. РНК, за редким исключением, одноцецочечные. • При этом азотистые ос нования располагаются внутри спирали. • С помощью водородных связей они об разуют специфические пары • А Т, Г Ц ДНК • А У, Г Ц – РНК

• Важнейшая функция РНК участие в процессе синтеза белков в клетке, • ДНК определение специфичности и передача единиц наследственности. • РНК информационная (несет информацию ДНК о первичной структуре белка), транспортная (транспортирует аминокислоты в рибосомы), рибосомная (образу ет рибосомы, собирает белки), ядерная (4 10% от общей). • Подавляющая часть ДНК сосредоточена в ядре, в цитоплазме эукариот содержится менее 1 % всей ДНК клетки. • ДНК эукариот почти вся находится в хромосомах ядер, лишь не большое ее количество содержится в митохондриях, а у растений и в плазмидах.

• Каждая хромосома состоит из цен тральной нити (хромонемы), вдоль которой расположены четкообразные струк туры (хромомеры). • Число хромосом колеблется от одной до 100, чаще 10 50. • У эукариот хромосомы всегда парные, по две каждого сорта. • Наследственными факторами или единицами наследственности у живых организмов являются гены, которые лежат в хромосомах в линейном порядке. Число генов в одной клетке человека находится в пределах между 5 и 125 тысячами.

• Бактерии содержат по одной хромосоме в форме замкнутой в виде кольца нити, состоящей из двухцепочной ДНК и не имеющей ядерной оболочки. • В цитоплазме многих бактерий кроме хромосомной ДНК содержатся добавочные маленькие кольца ДНК, при сутствие которых необязательно. Они получили название плазмид

• . Плазмиды не сут информацию для 2 200 белков. • Плазмидная ДНК составляет 1 15% от хромо сомной ДНК бактерий. • Плазмиды способны автономно размножаться и стабиль но наследуются. • Некоторые плазмиды способны включаться в хромосому бактерий. • В одной клетке бактерий мелких плазмид несколько десятков, крупных одна или две.

Генная инженерия бактерий • Генетическая рекомбинация заключается в обмене генами между двумя хромосомами. • Обмен генами и введение в клетку гена, принадлежащего другому виду, можно осуществить посредством генетической рекомбинации

Рекомбинация происходит в результате физического разрыва в хромосомах (М) и (F) и их последующего соединения с образованием двух новых хромосом (C 1 and C 2)

• Выделение фрагментов ДНК в хромосомах, несущих гены с необхо димыми свойствами, производят с помощью вырабатываемых клетками бактерий ферментов рестрикции (рестриктаз). • Рестриктазы распознают в ДНК специфичные для них участки длиной в 4 6 пар нуклеотидов и разрезают обе цепи ДНК посередине этих участков или с некоторым смещением. • В первом случае образуются обрывки с ровными (тупы ми) концами, во втором стороны оборванных цепочек ДНК чуть заходят одна за другую. Такие концы называются липкими, они могут слипаться между собой в силу комплиментарности.

• Скрепить липкие концы помогает ДНК лигаза, сшивающая фосфодиэфирные связи. • Для кодирования среднего белка из 400 аминокислот нужен участок ДНК длиной 1200 пар нуклеотидов. • В России и за рубежом из различных бактерий выделено несколько сотен рестриктаз, разрезающих ДНК в строго определенных местах, там, где фермент прикреплялся. • При этом было установлено, что концы фрагментов ДНК, полу ченные с помощью обработки хромосом одной и той же рестриктазой, способны слипаться между собой в силу комплиментарности.

• Две совершенно не схожие между собой последовательности ДНК (например, слона и лягушки) образуют одинаковые липкие концы, если эти ДНК обработать одной и той же рестрикта зой.

• . Это дало возможность получать фрагменты ДНК, содержащие желаемые гены. • Участки ДНК, разрезаемые рестриктазами, несложно разделить с помощью электрофореза. ДНК, обработанную рестриктазой, вводят в гель агарозы, помещенной в электрическое поле. • Под действием электрического поля фрагменты ДНК начинают перемещаться в пористом геле.

ДНК, обрабатываемая ДНК-лигазой

• Короткие фрагменты движутся быстрее, чем длинные, они отделяются друг от друга, не повреждаются и не утрачивают биологических свойств. • Скрепить сце пившиеся липкие концы фрагментов разных ДНК помогает фермент ДНК лигаза. • Она сшивает фрагменты с образованием полной структуры двойной спи рали ДНК.

• Следующей задачей функционально было активных, создание способных реплицироваться гибридных ДНК. • С этой целью интересующий фрагмент ДНК включают в состав вектора, с помощью которого он может быть размножен. • Век тор это молекула ДНК, способная переносить в клетку чужеродную ДНК любо го происхождения и обеспечивать там ее размножение. • Клетки, в которые вектор переносит вшитый в него ген, получили название реципиентов.

• Фаговые векторы тоже обладают рядом преимуществ. • Они могут включать в себя более крупные (более длинные) клонируемые фрагменты ДНК по сравнению с плазмидными векторами. • Перенос фагами клонируемого фрагмента в клетки в результате инфицирования ими последних является более эффективным, чем трансформация ДНК. • Фаговые векторы позволяют более эффективный скрининг (распознание) на поверхности агара колоний, содержащих клетки, несущие клонируемый ген.

• Главное свойство способности плазмид реплицироваться состоит в их независимо от хромосомы. По размеру ДНК плазмиды в 100 раз меньше плазмиде ДНК бактериальной таких размеров хромосомы. все же В может разместиться до сотни ге нов. • Плазмиды повышают устойчивость бактерий к внешним факторам, защищают неблагоприятных воздействий. их от

• Выяснилось, что многие мелкие плазмиды содержат по одному участку для нескольких рестриктаз. • Каждая такая рестриктаза разрежет кольцо плазмидной ДНК и переведет ее в линейное состояние. • Первая такая плазмида была открыта английским ученым Стэнли Коуэном в 1974 г. , которую он назвал своим именем. Она само стоятельно размножается. Концы ее способны слипаться между собой или с лю быми фрагментами другой ДНК, получаемыми под действием той же рестриктазы. Несет ген устойчивости к тетрациклину и легко обнаруживается выращи вании на среде с антибиотиком. при

• Следующая проблема заставить клетку воспринять рекомбинантную ДНК. • Объектом первых опытов по генной инженерии была избрана кишечная палочка Е. сoli. Клетки кишечной палочки выдерживают на холоде в растворе кальция, затем подвергают «тепловому шоку» . После этого клеточная мембрана становится проницаемой для поступления извне молекул ДНК. • В плазмиду была включена группа генов из хромосомы Е. сoli, ответственных за синтез аминокис лоты триптофана. Когда в клетки Е. сoli ввели гибридную ДНК, они стали выра батывать столько ферментов, участвующих в биосинтезе этой аминокислоты, что бактерии превратились в фабрику по производству триптофана.

• Помимо плазмид, в качестве векторов стали использовать и ДНК вирусов, размножающихся в клетках бактерий. • Клетка, получившая гибрид ную ДНК, размножившись, образует клон. • Это открыло путь для производства различных белков, лекарственных препаратов, гормонов, путем искусственного синтеза их генов и вставки их в клетки с помощью плазмид. Важнейший из них инсулин, получаемый из поджелудочной железы свиней.

Генная инженерия растений • Как ввести интересующие нас гены в растительную клетку, тем самым получить растения с необходимыми признаками и свойствами?

• С этой целью были использованы клетки корончатых галлов опу холей растений, образующихся на прикорневой части стебля у корневой шейки (отсюда название корончатый), на подземных (яблоня) и надземных (виноград) частях растений, у прививок в месте стыка привоя с подвоем. Корончатые галлы настоящая злокачественная опухоль.

• Их клетки способны распространяться по растению от первичного очага и давать начало вторичным опухолям метаста зам. • Болезнь поражает свыше 600 видов преимущественно двудольных растений. • Возбудителем болезни оказалась бактерия, выделенная из опухоли винограда в 1897 г. – Аgrobacterium tumefaciens (Pseudomonadaceae).

• Если этой бактерией, часто встречающейся в ризосфере, заразить здоровое, не пораненное растение, то в области раны разовьется типичный корончатый галл. • Опухолевые клетки рас тут в культуре быстро, без добавления фитогормонов. Для возникновения опухо ли достаточно кратковременного контакта с бактерией, само ее развитие проис ходит в отсутствии бактерии. • Под воздействием бактерии нормальные клетки превращаются в опухолевые, но как это происходит, долго не удавалось выяс нить.

• В 1974 г. было установлено, что патогенные штаммы агробактерии содер жат крупную плазмиду (150 200 тыс. пар нуклеотидов), отсутствующую у бакте рий патогенных штаммов. • Теряют плазмиду при температуре более 30°С. • Фактор, вызывающий образование опухоли, связан у агробактерии с крупными плазмидами

• В индуцированных с помощью плазмид опухолях проис ходит синтезопинов (производных аминокислот, в частности аргинина), исполь зующихся бактериями для питания. • Этот механизм осуществляется посредством переноса плазмидных генов, ответственных за синтез опинов, от бактерий к рас тениям и их последующее существование и проявление в растении без бактерий. • Эти гены были выявлены в плазмидах и в опухолевых растительных клетках бак терии.

• Попадая на ранку подходящего растения, начинают в течение двух часов активно синтезировать целлюлозу, играющую роль связующего жгута. • Еще через 4 часа начинается перенос плазмиды из бактерии в клетки растения. Заканчива ется он через 2 часа. • Теперь присутствие бактерий становится необязательным для развития опухолей. • Онкогены плазмиды встраиваются в растительное ядро, что ведет к опухолевой трансформации клетки. • Встраивание происходит с помо щью обратного действия матричной РНК. Плазмидные онкогены кодируют также синтез фитогормонов (ауксинов, цитокининов), способствующих росту и деле нию опухолевых клеток.

Получение трансгенных растений • Новые гены вводят в растения с помощью агробактерий. • Наиболее простой путь введения заражение пораненных растений с образованием корончатогалловых опухолей. • Однако опухолевые клетки не способны к регенерации растений. • При заражении растений некоторыми штам мами агробактерий образуются тератомы опухоли уродцы, состоящие из смеси дифференцированных клеток, способных дать начало различным частям расте ний.

• Если этих уродцев привить к здоровому корню, то можно получить нор мальные растения с чужеродными генами, введенными через агробактерию. • Од нако потомство таких растений утрачивало новый признак. • Новый ген, введен ный с онкогенами, не мог пройти через мейоз, что обусловлено защитой против опухолевых генов. • Повреждение онкогенов приводило к тому, что вставленные гены наследовались в потомстве клетки с освобожденными от онкогенов, но не поврежденными участками ДНК.

• Участки с вставленным геном и генами опинов стали культивировать на среде с добавлением фитогормонов, образованием каллуса и развитием растения. • Лишенная онкогенов т ДНК не мешает регенерации растительной клетки, способна пройти через мейоз и наследоваться в потомстве. • Для переноса генов с агробактериями их выдерживают некоторое время с прото пластами растительных клеток. • Голые протопласты более проницаемы для круп ных молекул, чем одетые клетки. • Кроме протопластов можно использовать мезофильные клетки листьев

Получение трансгенных животных. • Эксперименты показали, что культивируемые клетки высших животных становятся носителями новых наследственных свойств и продуцируют новые для них вещества. • Однако методы генетической инженерии для млекопитающих и особенно сельскохозяйственных животных пока слабо разработаны. • Одной из причин этого является то обстоятельство, что до сих пор не найдены эффективные и надежные векторы – плазмиды, которые могли бы вносить нужные гены в клетки животных

• Другой и, очевидно, главной причиной является глубокая дифференциация клеток у высших животных. • Поскольку из соматических клеток высших животных получить целый многоклеточный организм не представляется возможным, этот путь нельзя использовать для переноса генов в многоклеточное животное. • Новый подход для направленного изменения генома высших животных основан на введении в зиготу или ранний эмбрион клонированных эукариотических генов в составе бактериальных плазмид. • Животных, в геном которых интегрируют чужеродные гены, называют трансгенными.