Генная и клеточная терапия Функции нуклеиновых кислот

Генная и клеточная терапия

Функции нуклеиновых кислот в клетке Сплайсинг и процессинг РНК Трансляция Геномная ДНК ми. РНК микро. РНК ми. РНК белок

Генная терапия – лечение, основанное на введении в клетки организма ДНК или РНК генная терапия (генотерапия) — совокупность генно-инженерных (биотехнологических) и медицинских методов, направленных на внесение изменений в генетический аппарат соматических клеток человека в целях лечения заболеваний (из Федерального закона) Зародышевые клетки (гаметы, зиготы или эмбрион на ранних стадиях развития) Соматические клетки Добавление гена Замена гена Направленное подавление экспрессии гена Направленная элиминация клеток Фармацевтические препараты для генной терапии – клонированный ген, синтезированные РНК или ДНК

С помощью генной терапии можно регулировать любой из этапов экспрессии гена Геномная ДНК м. РНК Трансляция белок Транскрипция Точечная репарация дефекта в хромосоме Замещение дефектного гена полноценной копией Введение «трансгена» (дополнительной копии функционально активного гена) Подавление (регуляция) с помощью ми. РНК Подавление функциональной активности с помощью с продукции антагониста (доминант-негативные белки) Продукция «терапевтического» белка

Что используют для генной терапии: Олигонуклеотиды Короткие РНК (si. RNA, mi. RNA) Рибозимы Аптамерные олигонуклеотиды Плазмидные векторы Мини-кольца Искусственные хромосомы Репликативно-дефицитные вирусы Ретровирусы Лентивирусы Адено-ассоциированные вирусы Аденовирусы

Подавление продукции: олигонуклеотиды Короткие последовательности ДНК (аптамеры) или РНК (рибозимы, антисмысловые РНК) Направлены на подавление экспрессии гена- мишени (использование в противовирусной терапии)

Механизмы действия олигонуклеотидов 1. Формирование гетеродуплекса с ДНК Подавление репликации Подавление транскрипции 2. Связывание со старт-кодоном AUG Подавление трансляции белка

Механизмы действия олигонуклеотидов 3. Ингибирование процессинга РНК 5` Расщепление РНК 5`-экзонуклеазами Ингибирование сплайсинга и созревания 3` Предотвращение созревания (полиаденилирования) 4. Взаимодействие с белком Инактивация фермента, фактора роста фермент Ингибирование фактора транскрипции фактор транскрипции

Рибозимы РНК, обладающие каталитической активностью Несколько штук в одном векторе Повторное использование

Получение олигонуклеотидов Прямой синтез Клонирование в плазмидные и вирусные векторы

Применение олигонуклеотидов Легко разработать и синтезировать Короткое время жизни Для эффекта необходимы высокие концентрации: токсичность Адресная доставка Эндогенные микро. РНК используют как регуляторы адресной доставки

С помощью генной терапии можно регулировать любой из этапов экспрессии гена Геномная ДНК м. РНК Трансляция белок Транскрипция Точечная репарация дефекта в хромосоме Замещение дефектного гена полноценной копией Введение «трансгена» (дополнительной копии функционально активного гена) Подавление (регуляция) с помощью ми. РНК Подавление функциональной активности с помощью с продукции антагониста (доминант-негативные белки) Продукция «терапевтического» белка

Судьба генетического материала в клетке Генетический материал Деградация нуклеазами Образование конкатамеров Эписомальная локализация Интеграция в хромосому

Вектор – инструмент для переноса ДНК в клетки Вектор для клонирования (cloning vector) – используется для наращивания фрагмента ДНК Вектор для экспрессии (expression vector) – используется для экспрессии к. ДНК НЕВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ Плазмидные векторы Векторы на основе бактериофага лямбда Космидные векторы Искусственные хромосомы ВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ Ретровирусы Лентивирусы Адено-ассоциированные вирусы Аденовирусы

Плазмидные векторы Кольцевая, двуцепочечная ДНК Реплицируется в E. coli независимо от клетки-хозяина Содержит: участок для вставки к. ДНК (полилинкер) ген устойчивости к антибиотику промотор точка начала репликации

Получение плазмидных векторов 1. Синтез вставки (к. ДНК, кодирующей антисмысловую РНК) 2. Лигирование вставки и плазмиды 3. Трансформация E. coli 4. Отбор клонов на селективном антибиотике 5. Проверка содержания целевой плазмиды в клонах 6. Наращивание в необходимом объеме 7. Выделение и очистка

Преимущества и недостатки плазмидных конструкций Можно нарастить в больших объемах при низкой себестоимости Необходима высокоэффективная доставка Производство связано с культурами бактерий (эндотоксины) Достаточно быстро инактивируются клеткой (метилирование вирусного промотора) Можно обеспечить адресную и регулируемую продукцию трансгена с помощью введения специфичного промотора

Искусственные хромосомы Конструкции, собранные из фрагментов ДНК de novo (содержат теломеру и центромеру) Модифицированные существующие хромосомы (14 и 21 хромосомы человека)

Получение искусственной хромосомы на основе хромосомы 21 Gene Therapy. 2010

Искусственные хромосомы Встраивание в геном в качестве самостоятельной хромосомы(реплицируются в клеточном цикле) Перенос трансгенов большого размера Эффективная доставка достигается с помощью вирусных ампликонов

«Идеальная» система доставки генетического материала: Совместима с системами транспорта организма Биосовместима (иммуногенность, стабильность) Обеспечивает специфичность взаимодействия с клеткой- мишенью Обеспечивает подавление (избегание) эндосомальной деградации Обеспечивает адресную внутриклеточную (ядерную) локализацию Обеспечивает эффективную работу генетической конструкции

Репликативно-дефицитные вирусы В геноме вируса отсутствуют участки, кодирующие элементы, необходимые для репликации вируса и сборки вирусных частиц Распознается рецепторами клеточной поверхности (эффективная и адресная доставка, но активация иммунной системы) Для наращивания необходимы клетки-упаковщики (сложно нарастить в больших объемах)

Особенности вирусных векторов Упаковка Компактизация ДНК вирусной частицы обеспечивает совместимость с системами транспорта Распознаются рецепторами клеточной поверхности Обеспечивает специфичность взаимодействия с клеткой-мишенью Подвергаются эндоцитозу и умеют избежать деградации Закисление внутриэндосомальной среды Транспорт в ядро Используют активный транспорт в ядро благодаря сигналу ядерной локализации Организация генома Биосовместимость Сделаны из природных материалов: иммуногенны, но стабильны

Получение репликативно-дефицитных вирусов 1. Синтез вставки (к. ДНК, кодирующей антисмысловую РНК) 2. Лигирование вставки и промежуточной плазмиды 3. Трансформация E. coli 4. Отбор клонов на селективном антибиотике 5. Рекомбинация в E. coli 6. Очистка плазмиды и трансфекция клетокупаковщиков 7. Получение и очистка вирусных частиц

Преимущества и недостатки репликативнодефицитных вирусов Эффективная доставка Активация иммунной системы Встраивание в геном (перманентное присутствие в геноме реципиента) Трудоемкий процесс производства

Методы адресной доставки и контроля Биологические Конъюгация с лигандами Последовательности внутриклеточной локализации Сайт-специфичная интеграция в геном Физические Сила гравитации Магнитное поле Гидродинамическая сила В составе аэрозоля На крупном носителе В составе инъецируемого носителя Электрическое поле Ультразвук

Генная терапия: Вирусные и невирусные векторы используют для доставки к. ДНК или РНК в клетки и ткани Применяют для восполнения функции поврежденных генов продукции «терапевтических» белков подавления продукции нежелательного белка избирательной элиминации клеток

Клеточная терапия

Клеточная терапия Стратегия, направленная на замещение, восстановление или улучшение биологической функции поврежденных органов или тканей с помощью введения аутологичных или аллогенных клеток Данная стратегия может использовать как дифференцированные (специализированные) клетки (и тканевые эквиваленты, созданные на их основе), так и клетки, способные к специализации в различных направлениях (стволовые клетки) Bordignon C. et al. , Hematologica 1999; 84: 1110 -1149

Стволовые клетки опосредуют регенерацию тканей Figure 21 -1 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

История открытия стволовых клеток 1909 – гемопоэтические стволовые клетки Maximow A. A. Folia Haematologica. 1909. 8: 125— 134. Cтволовые клетки во взрослом организме открыты в 1909 году 1968 – мезенхимальные стволовые клетки Friedenstein A. J. et al. Transplantation. 1968. 6 (2): 230– 47. Александрович Максимов (1874, Санкт-Петербург – 1928, Чикаго) 1998 – эмбриональные стволовые клетки человека Thomson J. A. et al. Science. 1998. 282: 1145 -1147. Oct 4 Sox 2 Lin 28 c-Myc Nanog Klf 4 2006 – индуцированные плюрипотентные клетки Takahashi K, Yamanaka S. Cell. 2006. 126(4): 663 -76.

Стволовые клетки – это клетки, способные к самообновлению посредством деления и к дифференцировке в специализированные клетки тотипотентные Эмбриональные стволовые клетки (плюрипотентные) Все ткани организма содержат стволовые клетки Тканеспецифичные стволовые клетки (мультипотентные)

Клетки-предшественники располагаются в «нишах» Ниша - физиологически ограниченное микроокружение, в котором располагаются стволовые клетки (Schofield, 1978) Состоит из поддерживающих клеток (в костном мозге - остеобласты или эндотелий) Поддерживает баланс между самообновлением и дифференцировкой Защищает от неблагоприятных воздействий

Примеры ниш Стволовая клетка Расположение Клетки «ниши» Гемопоэтическая СК Эндостель; рядом с кровеносными сосудами (в их стенке) Остеобласты, остеокласты, мезенхимальные клетки, эндотелий СК скелетных мышц Под базальной пластинкой на мышечном волокне Мышечные волокна? Нейральные СК Субвентрикулярная зона Эндотелий СК кишечного эпителия Дно крипты Фибробласты? Клетки Панета? СК эпидермиса Волосяная сумка Клетки сосудистой стенки? адапт. из Morrison and Spradling. Cell 132, 598– 611, February 22, 2008

Схема ниши для HSCs в костном мозге

Схема ниши для СК в скелетной мышце

Мобилизация Активация резидентных стволовых клеток: открепление от ниши, пролиферация, дифференцировка, выход из депо (направленная миграция) Происходит под действием цитокинов, гормонов, гипоксии, физической нагрузки, терапии лекарственными препаратами (статинами, ингибиторами АТ 1), воспаления, травмы

Вероятные механизмы действия клеточных препаратов • Тканезамещение (формирование ткани de novo введенными клетками) • Секреция факторов роста • стимуляция трофики • подавление апоптоза • активация резидентных стволовых клеток

In vivo МСК располагаются в стенке кровеносных сосудов артериолы капилляры адвентиция Corseli M. , ATVB. 2010; 30: 1104 -09 Lin G, Stem Cell Dev. 2008; 17(6): 1053 -64

МСК стимулируют регенерацию тканей Дифференцировка в специализированные клетки Контактное взаимодействие с клетками поврежденной ткани Продукция паракринных факторов и внеклеточного матрикса Ангиогенез Воспаление и иммунный ответ Жизнеспособность дифференцированных клеток поврежденной ткани Активация тканеспецифичных клеток

Секреторные эффекты МСК факторы роста хемокины цитокины биоактивные липиды Эндотелий Нервные окончания Дифференцированные клетки Иммунные клетки Тканеспецифичные СК Циркулирующие СК микро. РНК

Развитие сосудистой сети в матригеле под влиянием МСК 700 тыс. МСК человека Контроль Окраска на СD 31 мыши 100 мкм без клеток +b. FGF 100 мкм + МСК

МСК стимулируют восстановление кровотока Количество сосудов p<0. 01 Сосуд / волокно 2. 5 2. 0 1. 5 1. 0 0. 5 0. 0 Без клеток Без Ишемия + ишемии клетки Кровоток (лазер-допплер) Кровоток % ишемия + клетки 60 40 20 ишемия Введены клетки 01 5 10 дни

Введение МСК после инфаркта миокарда улучшает функцию сердца СКЖТ в периинфарктной зоне сердца крысы через 7 дней после введения Фракция выброса левого желудочка (ЭХОКГ) через 1 месяц после ИМ у крыс % ФВ 60 p< 0, 01 40 20 0 - СКЖТ, меченные DAPI Контроль СКЖТ Облученные СКЖТ

МСК стимулируют рост кровеносных сосудов и нервных окончаний Активация эндотелиальных клеток: продукция ангиогенных и подавляющих апоптоз факторов роста (VEGF, b. FGF, HGF, TGFβ) МСК VEGF, b. FGF, HGF, Ang 1 Стабилизация формирующихся сосудов: выполняют функцию перицитов PDGF-BB, TGF-beta Стимуляция роста нервных окончаний: продукция нейротрофических факторов (BDNF, GDNF, NGF, NENF) Миелинизация растущих нервов: выполняют функцию шванновских клеток

Клетки, предлагаемые для терапии Дифференцированные клетки взрослых тканей (фибробласты кожи, гепатоциты, клетки мононуклеарной фракции крови) Стволовые клетки Эмбриональные Клетки внутренней массы бластоцисты (ЭКО) Тканеспецифичные прогениторные клетки плода (аборты после 20 недели) Соматические (аутологичные и аллогенные) циркулирующие в крови; из костного мозга (мезенхимальные и гемопоэтические); стромальные из жировой ткани; миобласты скелетных мышц; другие региональные предшественники (ольфакторный эпителий) Индуцированные плюрипотентные клетки

Получение клеточных препаратов Выделение клеток из ткани Экспланты (только культивирование) Ферментативная обработка Центрифугирование Очистка (обогащение) Иммуносортинг Селективная адгезия Селективные среды культивирования Культивирование

Выделение клеток из жировой ткани Жировая ткань Ферментативная обработка Разделение на фракции Лизис эритроцитов в осадке Осадочная фракция: клетки стромы, сосудов, лейкоциты, эритроциты Фильтрация Осаждение Культивирование через 5 дней после выделения

Препараты аутологичных стромальных клеток жировой ткани Лечение пародонтита (пародонтоза) Стимуляция ангиогенеза в ишемизированных тканях Восстановление периферических нервов при травмах и ЦНС при нейродегенеративных заболеваниях Лечение стрессового недержания мочи и обратного заброса мочи у женщин Лечение свищей и фистул в проктологии Восстановление костных дефектов Введение в кожу при истонченном фенотипе и недостаточном слое подкожной жировой клетчатки

Выделение фибробластов дермы из биоптатов кожи биоптат 3 х3 мм Ферментативная обработка Осаждение Культивирование Через 2 недели культивирования Маркерный антиген фибробластов CD 90 (красная флуоресценция). Эластин (зеленая флуоресценция). Ядра окрашены DAPI (синяя флуоресценция)

Препараты аутологичных фибробластов кожи Заживление ран Лечение ожогов Лечение трофических язв Лечение возрастных изменений кожи, атрофических рубцов

Выделение клеток-предшественников из костного мозга аспират Суспендирование Лизис эритроцитов Культивирование Дифференцировка в микромассе в хондроциты

Выделение клеток из крови Кровь мононуклеарная фракция Культивирование

Индуцированные плюрипотентные клетки способны дифференцироваться в различные типы клеток Nanog Oct 4 Sox 2 Lin 28 c-Myc Klf 4 дифференцировка яйцеклетки сперматозоиды печень легкие кишечный эпителий DOPA- нейроны двигательные нейроны кардиомиоциты ГМК эндотелий лимфоциты

Дифференцировка сопровождается снижением плюрипотентности и изменением эпигенетического статуса (Waddington, 1957).

Дифференцировка сопровождается эпигенетическими изменениями Подавление экспрессии генов, поддерживающих плюрипотентность Активация экспрессии мастер-генов дифференцировки

Инактивация генов, поддерживающих плюрипотентность Метилирование гистонов Деацетилирование гистонов Метилирование ДНК

Индуцированные плюрипотентные клетки Эмбриональные Аутологичные соматические Аутологичные ИП-клетки Доступность нет да да Дифференцировка in vivo да с ограничениями да Вероятность трансформации после трансплантации да, тератомы ? да, тератомы Секреторная активность да да - Перенос инфекций да нет Иммунологическая совместимость нет да да

Ближайшие перспективы применения СК в медицине На пленках и носителях для лечения язв, восстановления костной ткани Раневые повязки протезов сосудов Восстановление кровоснабжения ишемизированных тканей

Ограничения в применении препаратов клеток Иммунологическая совместимость Нежелательный рост (трансформация) Время жизни трансплантированных клеток в ткани-мишени Перенос инфекций Сохранение свойств после длительного культивирования

Клеточная терапия: Трансплантация клеток или тканевых эквивалентов на их основе для замещения, восстановления или улучшения биологической функции поврежденных органов или тканей

Контрольный вопрос Что используется в качестве препаратов для генной и клеточной терапии?

Тканевая инженерия: принципы и методы инженерии и естественных наук для фундаментального понимания структурно-функциональных взаимодействий в тканях млекопитающих в норме и при патологии, а также разработка биологических заместителей для восстановления, поддержания или улучшения функций ткани

Продукты тканевой инженерии Гибридные продукты, состоящие из биологических (клетки) и небиологических (полимерные материалы) компонентов Индукторы специфического ответа ткани (регенерации) Клетки, свойства которых были значительно изменены in vitro

Сосудистые протезы

Восстановление кожи

Восстановление кожи

Восстановление костной ткани

Термочувствительные покрытия для создания клеточных пластов

Схема операции по трансплантации роговицы

Трансплантация многослойных клеточных пластов

Компактизация ДНК в искусственном векторе Взаимодействие с поликатионами Липосомы Искусственные полимеры Природные полимеры Поликатионы обеспечивают неспецифическое связывание вектора с поверхностью клетки

Лиганды обеспечивают взаимодействие с рецепторами Лиганд Клетка-мишень Трансферрин Клетки раковых опухолей Фолат Клетки раковых опухолей Анти HER 2 -антитела Клетки раковых опухолей Галактоза Рецептор к асиалогликопротеидам на гепатоцитах Манноза Макрофаги

Предотвращение деградации в эндосомах Субъединица 2 гемагглютинина вируса гриппа Меллитин Производные полиакриловой кислоты Полиэтиленимин (протоновая губка) Полиамидоаминные дендримеры

Биосовместимость искусственных систем доставки Удаление или энзиматическая модификация Cp. G- последовательностей ПЭГилирование Присоединение производных полиакриловой кислоты N-(2 -гидроксипропил)метакриламид

Этапы направленной доставки Этап локализации Процесс Место введения - тканьмишень Накопление в ткани-мишени Ткань мишень – клеткамишень Накопление или связывание с клеткамимишенями Поверхность клетки – внутриклеточная локализация Интернализация клеткой и заданная внутриклеточная локализация Ядерная локализация – хромосомная интеграция Сайт-специфичная интеграция, а не хаотичная

Магнетофекция ПРИНЦИП: магнитные наночастицы смешивают с НК или векторами в буфере, помещают на клетки, которые помещают на магнит IN VIVO: трансфекция сегментов кровеносных сосудов и ЖКТ ОГРАНИЧЕНИЯ: противодействия гидродинамики тока крови; накопление магнитных наночастиц

Гидродинамический метод доставки ПРИНЦИП: быстрое внутривенное введение больших объемов растворов ДНК IN VIVO: трансфекция гепатоцитов ОГРАНИЧЕНИЯ: оседает именно в печени, сложно добиться трансфекции иных тканей

Местная имплантация вектора ПРИНЦИП: коллагеновая или фибриновая губка инфильтрируется раствором вектора и подвергается сушке-замораживанию, при помещении в ткань (на раневую поверхность) клетки, заселяющие губку, поглощают генетический материал IN VIVO: заживление ран, восстановление дефектов хрящей и костей, стенты

Инъецируемые имплантаты ПРИНЦИП: смешивание ДНК с полимерами (дендримерами), на основе поли(лактид-когликолид) и гликофурола, образование нано или микрочастиц IN VIVO: различные ткани ОГРАНИЧЕНИЯ: проникает в клетки, связывающие эти полимеры

Аэрозольная доставка ПРИНЦИП: смешивание ДНК или векторов с полиэтиленимином, смешивание с компонентами для аэрозольного распыления IN VIVO: легкие ОГРАНИЧЕНИЯ: полиэтиленимин высокотоксичен

Доставка с помощью ультразвука ПРИНЦИП: ДНК доставляется в составе микропузырьков или липосом, ультразвук вызывает высвобождение ДНК из носителя IN VIVO: различные ткани ОГРАНИЧЕНИЯ: сложно обеспечить локализацию суспензии ДНК

Доставка с помощью электрического поля ПРИНЦИП: приложение электрического разряда вызывает деполяризацию мембран и повышает их проницаемость IN VIVO: ткани, доступные для приложения разряда (мышцы, сосуды) ОГРАНИЧЕНИЯ: доступность тканей для приложения разряда

Адресная экспрессия: тканеспецифичные промоторы TF Промотор гена, специфичного для эндотелия Х Х Vector or virus Эндотелий Гладкомышечная клетка

Регуляция экспрессии трансгена с помощью эндогенных микро. РНК гепатоциты не содержат mi. R-142 -3 p антиген-презентирующие клетки содержат mi. R-142 -3 p

Хоминг и интерстициальная миграция Хоминг – процесс распределения клеток по тканям организма с током крови до распознавания и взаимодействия с микрососудистым эндотелием в участкемишени Интерстициальная миграция – активное амебоидное движение клеток под действием экстраваскулярных направляющих факторов, не зависит от тока крови

Адгезия и инвазия изменение конформации и поляризация 1 и 2 интегринов PSGL-1 Е-селектин катепсин L Р-селектин VEGF SDF-1 HMGB 1 некроз воспаление ишемия

Мобилизация vs. трансплантация Трансплантация Мобилизация Инвазивность Да, для аутологичных Нет Использование специфичного типа клеток Да Нет Необходимость выделения клеток из тканей Да Нет Наращивание клеток в культуре: Да Нет -Возможность многократного умножения -Риск передачи инфекций -Риск накопления геномных аберраций Выживание после введения ? в ткань N/A

Выделение клеток-предшественников из аневризмы сердца Ферментативная обработка Иммуномагнитная селекция c-kit+ клеток Осаждение - с-kit+ клетки-предшественники Маркеры клеток-предшественников Предшественники эндотелия (CD 105) Малодифференцированные клетки (c-kit+) Культивирование

Иммуноселекция: сортировка в потоке сигнал на ФЭУ лазеры + -

Иммуномагнитная селекция Мечение антителами, конъюгированными с магнитными микрочастицами Помеченные клетки остаются на магните в электромагнитном поле, удаляются негативные клетки Помеченные клетки можно смыть с колонки после снятия электромагнитного поля