Генетика Возможности диагностики муковисцидоза в условиях РФ инициатива

Генетика. Возможности диагностики муковисцидоза в условиях РФ (инициатива РАН и МГНЦ) Елена Ивановна Кондратьева, научно-клинический отдел муковисцидоза ФГБНУ «МГНЦ»

Показания к медико-генетическому консультированию • Наследственное заболевание в семье • Неблагоприятное течение беременности • Повторные спонтанные аборты, мертворождения • Близкородственные браки • Возраст матери старше 35 лет, возраст отца • Рождение ребенка с врожденными пороками развития (множественными и изолированными) • Задержка/опережение физического развития пре- и постнатальная • Задержка темпов психо-моторного развития, утрата ранее приобретенных навыков • Внезапное ухудшение состояния ребенка (рвота, судорожный синдром, потеря сознания, нарушение мозгового кровообращения) • Необычный запах от тела, волос, биологических жидкостей • Мышечная слабость, мышечная гипотония • Нарушение пигментации кожи

Разработка МВ диагностических тестов и критерии Потовый тест Gibson & Cook 1959

Тесты диагностики МВ Потовый тест Gibson & Cook Разность назальных потенциалов Knowles, Gatzy, Boucher 1959 1983

Тесты диагностики МВ Потовый тест Gibson & Cook Разность назальных потенциалов Knowles, Gatzy, Boucher Ген CFTR 1959 1983 Riordan et al. 1989

Тесты диагностики МВ Потовый тест Разность кишечных потенциалов Gibson & Cook Veeze et al. Разность назальных потенциалов Knowles, Gatzy, Boucher Ген CFTR Riordan et al. 1959 1983 1991 1989

Тесты диагностики МВ Потовый тест Разность кишечных потенциалов Gibson & Cook Veeze et al. Разность назальных потенциалов Knowles, Gatzy, Boucher ИРТ Неонатальный скрининг Hammond et al. Ген CFTR Riordan et al. 1959 1983 1991 1989

Консенсус по диагностике МВ-временная шкала Американский фонд МВ (CFF) консенсус по диагностике Rosenstein et al. Критерии диагностики 1998: • Фенотипические характеристики, МВ у 1998 Разность назальных потенциалов Knowles, Gatzy, Boucher Riordan et al. Gibson & Cook 1959 Veeze et al. Ген CFTR Потовый тест 1983 Разность кишечных потенциалов 1989 ИРТ Неонатальный скрининг Hammond et al. 1991 родственников или положительный неонатальный скрининг • Лабораторное подтверждение мутации CFTR: потовый тест Cl- > 60 mmol/l • или: определение мутаций в гене CFTR • или: разность назальных потенциалов, характерная для МВ

Консенсус по диагностике МВ-временная шкала Американский фонд МВ (CFF)-консенсус по диагностике Rosenstein et al. Европейское общество по муковисцидозу (ECFS) алгоритм диагностики De Boeck et al. 2006 Разность назальных потенциалов Knowles, Gatzy, Boucher Riordan et al. Gibson & Cook 1959 Veeze et al. Ген CFTR Потовый тест 1983 Разность кишечных потенциалов 1989 ИРТ Неонатальный скрининг Hammond et al. 1991

Консенсус по диагностике МВ-временная шкала Американский фонд МВ (CFF)-консенсус по диагностике Rosenstein et al. Американский фонд МВ (CFF)-консенсус по диагностике, включая неонатальный скрининг Farrell et al. Европейское общество по муковисцидозу (ECFS) Алгоритм диагностики 1998 De Boeck et al. 2006 Разность назальных потенциалов Knowles, Gatzy, Boucher Riordan et al. Gibson & Cook 1959 Veeze et al. Ген CFTR Потовый тест 1983 Разность кишечных потенциалов 1989 ИРТ Неонатальный скрининг Hammond et al. 1991 2008

Критерии диагностики MВ 1 или > симптомов МВ Потовый тест 2 x Cl- > 60 mmol/l или родственники с МВ или положительный неонатальный скрининг И 2 мутации гена CFTR, приводящие к МВ или CFTR функция типичная для МВ Rosenstein 1998 De Boeck 2006 Farrell 2008 Castellani 2008 Mayell 2009

Европейское общество по муковисцидозу (ECFS) Рекоммендации по диагностике (2006) Основные положения: Потовый тест: пограничные значения Cl-3060 mmol/l Рекоммендуется измерение разности назальных потенциалов; указывается разность кишечных потенциалов Дисфункция CFTR Пограничная категория: дисфункция/неклассический МВ De Boeck et al. Thorax 2006

Американский фонд МВ (CFF) Рекоммендации по диагностике (2008) Основные положения: Потовый тест: пограничные значения Cl- 40 -60 mmol/l Указывается измерение разности назальных потенциалов/разность кишечных потенциалов не используется Пограничная категория: неопределенный диагноз МВ Farrell et al. , J Pediatr 2008

Основные документы

Муковисцидоз- рецессивное заболевание CFTR N|mut Здоровый Носитель МВ CFTR N/N CFTR N|mut CFTR mut|mut

Классификация мутаций гена CFTR 2 ст № 2 N I II III Нет синтеза Нарушена сборка белка Блок канала Терапия разрабатывается IV V-VI Быстрое Снижено кол-во N закрытие канала белка Корректоры VX 809 (люмакафтор) VX-661 N 6022 (+противовоспали тельное действие) Потенциаторы –восстановление (активация) функции ионного канала Калидеко (ивакафтор, VX-770) 16

Виды мутаций • В настоящее время известны 2019 мутации • По состоянию на 17 марта 2017 года на веб-сайте CFTR 2 аннотируемая 322 варианта: CF-клинически значимые мутации: 281 Варианты различного клинического значения: 21 Не связанные с заболеванием: 12 Варианты неизвестного значения: 8 17

2011 -2015 гг 2011 Генетическое исследование охват, % доля выявленных мутаций, %* – две выявленные мутации, %* – одна выявленная мутация, %* – обе мутации не выявлены, %* F 508 del / F 508 del, %* F 508 del / не. F 508 del, %* не. F 508 del / не. F 508 del, %* F 508 del, аллельная частота, %* СFTRdele 2, 3, аллельная частота, %* E 92 K, аллельная частота, %* 2012 2013 2014 2015 91, 8 91, 1 87, 5 87, 7 88, 2 80, 0 80, 4 79, 1 79, 5 81, 9 69, 1 69, 2 66, 1 66, 5 70, 4 21, 4 22, 4 25, 9 25, 2 23, 1 9, 5 8, 4 8, 0 8, 3 6, 5 32, 1 30, 3 30, 0 29, 1 27, 8 41, 2 44, 5 45, 7 46, 7 47, 6 26, 7 25, 2 24, 3 24, 2 25, 6 52, 79 52, 85 52, 21 51, 53 51, 67 6, 32 5, 91 5, 94 5, 93 5, 68 2, 65 2, 64 2, 58 2, 62 2, 43

№ mutations Frequent, % 1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 F 508 del 3849+10 kb. C>T 2184 ins. A G 542 X R 334 W 2789+5 G>A 3944 del. GT c. 1243 -1247 del 3849 G>A 4015 del. A CFTRdup 6 b-10 W 1310 X E 217 G R 1158 X 3659 del. C I 506 T 4428 ins. GA 1898+2 T>C R 75 X 681 del. C Q 493 R R 792 X D 110 H 574 del. A 51, 67 2, 10 1, 80 1, 18 0, 80 0, 33 0, 29 0, 22 0, 16 0, 12 0, 10 0, 08 0, 06 0, 04 0, 04 2 5 8 11 14 17 20 23 26 29 32 35 38 41 44 47 50 53 56 59 62 65 68 71 CFTRdele 2, 3 2143 del. T N 1303 K L 138 ins 3821 del. T 3272 -16 T>A S 466 X* R 553 X 621+1 G>T S 1159 F R 347 P 1898+1 G>A S 1159 P 1898+1 G>C 1248+1 G>A R 114 H D 1152 H 4382 del. A 624 del. T D 579 Y A 96 E 2183 AA>G 175 del. C p. I 1328 K 5, 68 1, 90 1, 35 1, 07 0, 45 0, 31 0, 27 0, 18 0, 16 0, 10 0, 08 0, 06 0, 04 0, 04 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60 63 66 69 72 E 92 K W 1282 X 1677 del. TA 394 del. TT S 1196 X W 1282 R R 1066 C 712 -1 G>T S 945 L R 1162 X L 1335 P G 85 E 1716+1 G>A Q 98 R R 785 X 604 ins. A Y 84 X CFTRdel 4 -11 3085 -3088 del. TTGA Y 569 H 4022 ins. T CFTRdele 8 2184 del. A K 598 ins 2, 43 1, 82 1, 29 0, 82 0, 33 0, 29 0, 26 0, 12 0, 10 0, 08 0, 06 0, 04 0, 04 0, 02 Список мутаций ( регистр 2015)

№ 88 91 94 97 100 103 106 109 112 115 118 121 124 127 130 133 136 139 142 145 148 151 Мутация p. E 1433 G W 401 X c. 1580 dup. A 1717 -1 G>A L 1093 P G 551 D L 812 X Q 1412 X G 480 S G 461 E CFTRdele 2 -8 296+1 G>T Q 359 K-T 360 K E 403 D 4095+1 G>T p. W 361 X P 205 S c. 1219 del. G 324 del. C 2114 del. T 1027 del. G 2043 del. G Частота, % 0, 02 0, 02 0, 02 0, 02 0, 02 0, 02 № 89 92 95 98 101 104 107 110 113 116 119 122 125 128 131 134 137 140 143 146 149 152 Мутация Q 290 X 4005+1 G>A L 568 F 1525 -1 G>A R 851 X W 19 G c. 3532 -3535 dup CFTRdele 19 -22 3272 -11 A>G T 604 I E 92 A c. 1679+1 G>T p. I 530 T p. F 1078 I S 549 N Q 1476 X CFTRdele 1 -11 541 del 4 4040 del. A 4025 del. G 3321 del. G 1680 -1 G>C Частота, % 0, 02 0, 03 0, 02 0, 02 0, 02 0, 02 0, 02 № 90 93 96 99 102 105 108 111 114 117 120 123 126 129 132 135 138 141 144 147 150 153 Мутация L 863 R 185+1 G>T P 988 R K 1468 R R 709 X 3272 -26 A>G 4005+1 G>T D 572 N 4374+1 G>A Y 1032 C G 1249 E R 1102 X 2790 -2 A>G p. Q 1038 X Y 569 D 406 -1 G>A p. T 1036 N c. 869+2 T>G 3791 del. C 3457 del. A 1366 del. G 663 del. T Частота, % 0, 02 0, 02 0, 02 0, 03 0, 02 0, 02 0, 02

Алгоритм ДНК-диагностики • Таргетный анализ (поиск частых мутаций) Российская панель частых мутаций гена CFTR содержит 30 мутаций Суммарная доля мутаций составляет 80% от общего числа мутантных аллелелей гена CFTR, встречающихся у больных муковисцидозом России • Секвенирование гена CFTR Включая кодирующие и регуляторные области гена Частота выявления мутаций 98, 7%

Пациент и его семья

Значение ДНК-диагностики для пациента • Подтверждение диагноза • Определение прогноза течения заболевания • Новые возможности терапии

CFTR - модуляторы Потенциаторы – мишенью данных препаратов являются молекулы мутантного белка CFTR, располагающиеся в апикальной мембране. Действие потенциаторов направлено на восстановление (активацию) функции ионного канала, образованного мутантным белком CFTR (мутации III-IV классов) - Генистин; Калидеко (VX-770). Корректоры – лекарственные средства, позволяющие мутантному белку CFTR пройти через систему внутриклеточного качественного контроля и занять правильное расположение на апикальной мембране (мутации II класса) - 4 фенилбутират/генистин; аналог силденафила-КМ 11060; куркумин; VX-809. Rowe SM et al. , New Engl J Med 2005 Вещества, способствующие «прочитыванию» стоп-кодонов в CFTR-m. RNA и предотвращению преждевременной терминации синтеза молекулы белка, используются при лечении пациентов, имеющих нонсенс-мутации (мутации I класса).

Клинические исследования по муковисцидозу ( 01. 06. 2016) Вид количество 1 2 3 4 СFTR модуляторы Антибактериальные препараты 10 2 2 0 4 1 0 0 Противовоспалительные Нутритивная поддержка 2 2 0 1 –на животных 1 0 1 1 0 0 Муколитики Наблюдательные Всего 3 3 22 0 2 1 2 9 8 0 3 3

ДНК-диагностика в жизни семьи • Для родителей ребенка: Прогноз потомства Возможность пренатальной диагностики Использование репродуктивных технологий (ЭКО) • Для братьев, сестер и других родственников Выяснение статуса носителя мутации

Фармакогенетика при муковисцидозе 2 ст № 3 В зависимости от активности ферментов биотрансформации выделяют фенотипы УЛЬТРА БЫСТРЫЙ НЕБЕЗОПАСНО ЭФФЕКТИВНО МЕДЛЕННЫЙ БЕЗОПАСНО ЭФФЕКТИВНО ПРОМЕЖУТОЧНЫЙ НЕБЕЗОПАСНО НЕЭФФЕКТИВНО БЫСТРЫЙ (НОРМАЛЬНЫЙ) БЕЗОПАСНО НЕЭФФЕКТИВНО ДНК тест

Разработки научно-клинического отдела муковисцидоза ФГБНУ « МГНЦ» и отделения муковисцидоза ГБУЗ МО «МО КДЦД» позволяют определить тактику терапии: 2 ст № 4 Стандартная дозировка Снизить дозу Увеличить дозу Альтернативные методы терапии

Ген CFTR и рецидивирующий (или хронический) панкреатит Панкреатит может быть обусловлен мутациями в ряде генов и встречаться как у людей без МВ, так и на его фоне. Мутации в гене CFTR встречаются у 32 -48% больных с хроническим панкреатитом с аутосомно-рецессивный типом наследования и у 10 -15% больных МВ с сохранной функцией поджелудочной железы. Больные МВ с «мягкими» мутациями чаще имеют панкреатит. Помимо мутаций в гене CFTR при панкреатите встречаются мутации в генах SPINK 1 (ингибитор сериновой протеазы, тип Казал 1; serine protease inhibitor, Kazal type 1), PRSS 1 (катионный трипсиноген), A 1 AT (α 1 -антитрипсин). Предполагают возможность дигенного наследования панкреатита: часто у пациентов с панкреатитом обнаруживают гетерозиготное носительство мутаций в генах CFTR и PRSS 1 или SPINK 1

Куда обращаться : • За направлением на генетическую диагностику - в отделение муковисцидоза ГБУЗ МО «МОКДЦД» • Для проведения ДНК диагностики и генетического консультирования в ФГБНУ "Медико-генетический научный центр" , Поликлиническое отделение, 115478, Москва, ул. Москворечье д. 1. www. med-gen. ru, Тел. 8 (495)111 -03 -03

За направлением на генетическую диагностику - в отделение муковисцидоза ГБУЗ МО «МОКДЦД» Правила записи на консультативный прием и в дневной стационар в отделение муковисцидоза ГБУЗ МО «МОКДЦД» • Часы работы отделения с 9 до 18 часов. Телефон регистратуры: тел. 8 (495) 587 -33 -66. Часы записи на прием с 9. 00 до 15. 00. • Прием пациентов производиться согласно микрофлоре дыхательного тракта. При записи необходимо назвать дату последнего бактериологического анализа и его результат, а также иметь в распечатанном виде на прием. Анализ должен быть сдан за 2 недели до приема в одной из двух бактериологических лабораторий г. Москвы: 1. ГКБ № 15 им. О. М. Филатова, ул. Вешняковская 23, бактериологическая лаборатория, тел. 8 (495) 375 12 24 2. Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н. Ф. Гамалеи Российской академии медицинских наук, лаборатория молекулярной эпидемиологии госпитальных инфекций (адрес: улица Гамалеи 18, тел. 8 (499) 193 55 94, 8 (903) 536 62 37) Для прикрепления к центру необходимо: 1. Получить в поликлинике направление по форме 057 у в отделение муковисцидоза ГБУЗ МО «МОКДЦД» по адресу: МО, г. Мытищи, ул. Коминтерна, д. 24 а, стр. 1. В направлении должно быть указано: для консультации, динамического наблюдения, обследования и лечения. Обязательно наличие даты, подписей, печатей. 2. Предоставить копии документов: паспорт родителя, свидетельство о рождении ребенка, страховой полис ребенка (если полис в виде пластиковой карты, то необходимо сопроводительное письмо страховой компании с датой получения полиса), СНИЛС, справка об инвалидности (при наличии), последняя выписка из стационара или амбулаторного приема в центре муковисцидоза, а для детей, которым необходимо исключить или подтвердить муковисцидоз - выписка из амбулаторной карты, справку о прививках, соскоб на энтеробиоз и кал на яйца глистов. 31

Куда обращаться: для проведения ДНК диагностики и генетического консультирования • Взять направление в МГНЦ в отделении муковисцидоза ГБУЗ МО «МОКДЦД» • Записаться на прием в ФГБНУ "Медико-генетический научный центр" , Поликлиническое отделение, 115478, Москва, ул. Москворечье д. 1. www. medgen. ru, Тел. 8 (495)111 -03 -03 ( четверг – Шабалова Лидия Абрамовна) • При необходимости секвенирования гена CFTR отделение муковисцидоза ГБУЗ МО «МОКДЦД» сделает консилиум специалистов.

Забор крови на ДНК диагностику – 1 раз • • • Не нужна подготовка. В отделении муковисцидоза до 16. 00. В поликлинике МГНЦ до 13. 00. Количество минимально 3 мл. Пациент, родители, братья и сестры

• Важная информация для родителей: • В центре муковисцидоза проводится диагностика и лечение заболевания в рамках консультации или дневного стационара и с 15 января –суточного пребывания. • Организовано обследование новорожденных по программе неонатального скрининга, детей любого возраста из групп риска по направлению участковых педиатров, узких специалистов. • Потовые пробы проводятся с применением трех современных методик по определению проводимости пота на аппаратах - Нанодакт, Макродакт и модифицированный классический метод. Консилиумы специалистов центра проводятся 1 раз в неделю • Консультации диетолога, кинезиотерапевта проводятся по предварительной записи. Работает горячая линия по всем вопросам, связанным с диагностикой, обследованием и лечением. Телефон горячей линии 8 -495 -228 -33 -88(пн-пт 10: 00 -14: 00) 34