Генетика развития растений Развитие = рост + дифференцировка

Генетика развития растений Развитие = рост + дифференцировка Развитие клетки, ткани, органа (морфогенез)

Меристемы растений Меристе́мы (с др.-греч. — «μεριστός» — делимый), или образовательные ткани, или меристематические ткани, — обобщающее название для тканей растений, состоящих из интенсивно делящихся и сохраняющих физиологическую активность на протяжении всей жизни клеток, обеспечивающих непрерывное нарастание массы растения и предоставляющих материал для образования различных специализированных тканей. Сейчас меристемы обычно рассматриваются как специализированные органы. Общие свойства меристем: Содержат пулы стволовых клеток (СК). По сути представляют собой ниши СК, способные а). Поддерживать недифференцированное состояние клеток и б). Продуцировать клетки, способные к дифференцировке Наличие центральной (ЦЗ) и периферических зон (ПЗ). ЦЗ состоит из недифференцированных клеток (СК), ПЗ - из клеток-потомков СК, вступивших на путь дифференцировки Работа определенных групп ТФ, подавляющих дифференцировку клеток. Обычно их гены экспрессируются в организующих центрах (котоорые есть не у всех меристем)

Меристемы растений АМ соцветия Вегетативная АМ побега Меристема цветка Апикальные меристемы (АМ) Латеральные меристемым Камбий камбий ксилема флоэма АМ корня зачаток чашелистика зачаток листа Интеркалярные меристемы Перицикл стела кора Перицикл Меристемы междоузлий «Нерегулярные» (дополнительные) меристемы Развиваются при определенных условиях Меристемы клубеньков Галлы и опухоли Раневой каллус

Первичные - закладываются в эмбриогенезе 3 - xylem pericycle lineage - phloem pericycle lineage Вторичные – закладываются в постэмбриональном развитии Меристемы растений

АМ корня SC – stem cells стволовые клетки Стволовые клетки в апикальных меристемах побега и корня 5 АМ побега OC / QC – organizing / quiescent center, организующий (покоящийся) центр

6 Стволовые клетки (stem cells): Делящиеся клетки, потомки которых либо остаются в том же состоянии, что и материнские клетки (обычно называемое «недифференцированным») и таким образом пополняют популяцию стволовых клеток, либо претерпевают дифференцировку и дают начало новым органам и тканям. Ниша стволовых клеток (stem cell niche): локальное микроокружение, среда, поставляющая факторы, необходимые для поддержания стволовых клеток. Определение стволовых клеток M. R. Tucker and T. Laux, TRENDS in Cell Biology 2007

7 Организация ниши стволовых клеток у животных и у растений Ниша стволовых клеток в яичнике Drosophila melanogaster Ниша стволовых клеток в корне Arabidopsis thaliana Scheres, NatRev. Mol Cell Biol (2007), V.8:345-354 Ниша стволовых клеток (stem cell niche): локальное микроокружение, среда, поставляющая факторы, необходимые для поддержания стволовых клеток.

8 Общий принцип организации ниши стволовых клеток дифференцированные клетки ранние стадии дифференцировки недифференцированные клетки внутриклеточный сигнал, предотвращающий дифферненцировку «организующий центр» (organizer) Sablowski, Trends in Cell Biology, 2004,14(11):605-611

мультипотентные плюрипотентные II III I олигопотентные Стволовые клетки: Обладают высокой потентностью 2. Способны к асимметричным делениям (самоподдержание + поставка клеток в зону дифференцировки) Клетки организующего центра («суперстволовые»): 1, 2. ++ 3. Делятся ОЧЕНЬ медленно 4. Источник сигнала, предотвращающего дифференциров-ку их самих и прилежащих клеток

Стволовая клетка Дифференцированная клетка Пополнение популяции столовых клеток Асимметричное деление стволовых клеток 10 Асимметричное деление

Генетический контроль структуры и функции апикальной меристемы побега В отличие от животных, растения всю жизнь продуцируют новые органы. Все постэмбриональное развитие – это результат функционирования побеговой и корневой апикальных меристем (ПАМ и КАМ). 11

ПАМ лист узел междоузлие фитомер Clark, Current Opinion in Plant Biology 2001 Строение апикальной меристемы побега 12

13 Строение апикальной меристемы побега CZ (central zone, центральная зона) –стволовые клетки (в т.ч. организующий центр) и их ближайшие потомки. Делятся медленно, нет признаков дифференцировки PZ (peripheral zone, периферическая зона) – дочерние клетки CZ. Скорость и направление делений клеток не постоянно; клетки способны к дифференцировке. Клональное разделение: L1 + L2 (туника), L3 (корпус) Гистологическое разделение (зоны): центральная, периферические и риб-зона RZ (rib zone, риб-зона) – зона закладки проводящей системы. Растущие и делящиеся клетки на разных стадиях дифференцировки.

14 «Симпластические поля» в апикальной меристеме побега

Скорость прохождения клеточного цикла в разных зонах ПАМ Besnard et al., 2011

16 Распределение гормонов в ПАМ

17 Взаимодействие факторов, регулирующих активность ПАМ

Изучение генетического контроля структуры и функции ПАМ методами классической («прямой») генетики: 18 Выявлены два классов мутантов, имеющих противоположный фенотип: мутанты с недоразвитием АМ (stm, wus, zll); мутанты с увеличением размера АМ (clv1, clv2, clv3, fas1, fas2) WT clavata1 wuschel shootmeristemless (clv1) (wus) (stm)

Мутанты с недоразвитием АМ WT wus stm 19

stm-5/+ x wus-1/+ 3 stm-5/+ 9 +/+ 3 wus-1/+ 1 stm-5/ wus-1 : : : По генотипу По фенотипу 4 stm-5 9 wt 3 wus-1 : : stm-5 wus-1 = stm-5 Вероятно, гены осуществляют последовательные этапы одного процесса: продукт STM действует раньше, чем продукт гена WUS эпистаз Изучение взаимодействия генов STM и WUS: Анализ фенотипа двойных мутантов stm wus (метод классической, прямой генетики) («сильные» аллели wus и stm)

21 Изучение взаимодействия генов STM и WUS: Анализ трансгенных растений с измененной экспрессией генов: ANT::STM (эктопическая экспрессия STM в листовых примордиях) 35S::WUS-GR (активация экспрессии WUS в меристеме) Отсутствие изменений в характере экспрессии WUS (и CLV3) - Отсутствие изменений в характере экспрессии STM и других KNOX генов, - Активация экспрессии CLV3 STM WUS ? STM WUS ? WUS и STM регулируют меристематическую активность клеток независимо друг от друга

22 Поддержание пула стволовых клеток в меристеме Пролиферация стволовых клеток в меристеме Роль генов STM и WUS в апикальной меристеме побега WUS STM

Мутанты по гену WUS (WUSCHEL) дикий тип wus Mayer et al., Cell 1998 23 в эмбриогенезе АМ образуется, но уменьшенная, состоящая из крупных вакуолизированных клеток; АМ побега формирует несколько листьев и прекращает свое развитие; на придаточных побегах могут закладываться цветки с нормальным числом чашелистиков и лепестков, но преращающих развитие с формированием единственной тычинки Гипотеза о функции гена WUS: ген необходим для формирования нормальной АМ в эмбриогенезе, для поддержания клеток ЦЗ апикальной меристемы в стволовом состоянии в процессе вегетативного и репродуктивного развития.

stm-1, stm-5 - аллели с высокой экспрессивностью мутантного признака («жесткие, суровые»): -АМ не закладывается в эмбриогенезе; -крупные вакуолизированные клетки между семядолями (на месте меристемы); -семядоли могут сливаться. stm-2 – «мягкая, слабая» аллель: АМ с небольшим числом клеток Образует 1-3 листа и несколько побегов из пазух листьев. Мутанты по гену STM (SHOOT MERISTEMLESS) stm-6 – аллель с самой низкой экспрессивностью: Мутанты цветут, но число органов цветка значительно меньше, чем в цветках дикого типа. 24 Гипотеза о функции гена STM: ген необходим для закладки АМ в эмбриональном развитии, для предотвращения дифференцировки клеток ЦЗ апикальной меристемы в процессе вегетативного и репродуктивного развития.

Мутанты с увеличенной АМ WT clv1 25

Мутанты по генам СLV1, CLV2, CLV3 (CLAVATA) многолистная розетка увеличение числа органов цветка фасциация стебля увеличение числа плодолистиков Плод «матрешка» Clavatus –лат. «булавовидный» Гипотеза о функции генов CLV: гены необходимы для ограничения размера АМ в эмбриогенезе и на всех стадиях постэмбрионального развития, а также для ограничения пролиферации ФМ.

27 Экспрессия генов STM, WUS, CLV1 и CLV3 в апикальной меристеме побега WUS – в ОЦ CLV1 – в ОЦ и рядом с ним, CLV3 – в L1, L2 над ОЦ

Экспрессия генов STM и WUS в апикальной меристеме побега Bowman J., Yuval E. Trends in Plant Science, 2000, V. 5., N. 3, pp. 110-115 28

29 Гены семейств KNOX (STM) и WOX (WUS) кодируют гомеодомен-содержащие транскрипционные факторы Гены семейства KNOX арабидопсиса Гены WOX у арабидопсиса и у других растений

Гомеодомен-ДНК - комплекс вариабельный уч. гомеодомен N С Структура транскрипционного фактора с ДНК-связывающим гомеодоменом 30 «Атипичный» гомеодомен ТФ WUS арабидопсиса Гомеодомен ТФ Pdx1 млекопитающих

Экспрессия гена STM в АМ побега 31 Moussian et al., The EMBO Journal 1998 Выявление экспрессии гена STM на разных этапах развития АМ методом гибридизации in situ KNOX GSE ELK HD N C Схема доменной организации белка STM

32 Транспорт продуктов генов KNOX в апикальной меристеме побега

Нарушение транспорта белка STM вызывает дефекты развития ПАМ Plant Journal, 2017

ТФ BELL (тоже из семейства TALE) – партнеры ТФ KNOX (обеспечивают транспорт KNOX в ядро)

35 Мишени STM Экспрессия гена AS1 (Asymmetric leaves1), отвечающего за развитие листового примордия, у мутантов stm-1 stm-1 дикий тип Взаимодействие STM и AS1-AS2 в апексе побега

Модель эпигенетической регуляции генов KNOX в дифференцированных клетках листьев wt as1 hira Lodha et al., 2013 KNOX promoter

STM активирует экспрессию гена CUC1 Гены CUC экспрессируются на границе между листовым примордием и меристемой Spinelli et al., 2011

38 Мишени STM в ПАМ STM STM IPT (биосинтез цитокинина) GA2ox (дезактивация гибереллинов) Jasinski et al. 2005

39 Взаимодействие STM (генов KNOX) и генов, вовлеченных в метаболизм цитокинина и гиббереллина в апексе побега Мишени STM в ПАМ Jasinski et al. 2005

Активация экспрессии KNOX важна для формирования сложных листьев

41 Транскрипционные факторы семейства WOX WUS-бокс (репрессия транскрипции) домен EAR (рекрутирование корепрессоров трнаскрипции) гомеодомен «древняя» клада «промежуточная» клада клада «WUS»

Ядерная локализация гибридного белка WUS-GUS (в клетках эпидермиса лука) Экспрессия гена WUS в АМ побега Экспрессия гена WUS в организующем центре меристемы Mayer et al., Cell 1998 42

мхи зеленые водоросли WUS/WOX9 про-ортолог линия WUS линия WOX9 линия WOX13 WOX13 Плауны Семенные растения Папоротники Покрытосеменные растения Голосеменные растения WUS/WOX5 про-ортолог WUS WOX5 Усложнение организации меристемы в ходе эволюции высших растений и сопровождается дупликацией и последующей «специализацией» генов семейства WOX Nardmann et al, 2009, 2012 43

Геном Gnetum gnemon – содержит про-ортолог GgWUS/WOX5 (до дупликации генов WUS/WOX5 в ходе эволюции), экспрессирующийся как в корне, так и в побеге Nardmann et al, 2009 pWUS-GgWUS/WOX5 wt Экспрессия pWUS-GgWUS/WOX5 у арабидопсиса обуславливает clv-подобный фенотип (фасциация стебля, формирование многочисленных цветков и органов цветка) 44 Роль про-ортолога WUS/WOX5 у голосеменных растений

45 Взаимодействие WUS и системы генов CLAVATA увеличение числа органов цветка фасциация стебля увеличение числа плодолистиков Плод «матрешка» многолистная розетка clv1, 2, 3  WUS overexpression

46 CLV1 и CLV2 кодируют рецепторные белки (c лейцин-богатым LRR–доменом), работающие в виде гетеродимера CLV1/CLV2 CLV3 – лиганд 12 а/к, связывается с рецепторным комплексом CLV1/CLV2 CLV3 CLV1 CLV2 Регуляция экспрессии гена WUS в АМ с участием белков CLAVATA

47 Гены-антогонисты - частое явление в генетике развития. По-видимому, они позволяют осуществлять тонкую регуляцию процессов развития. Дикий тип Сверхэкспрессия CLV3 мутант CLV3 Взаимодействие WUS и системы генов CLAVATA

дикий тип мутант clv3 35S::CLV3 48 CLV3 WUS CLV3 WUS Увеличение домена экспрессии CLV3 в растениях ANT::WUS Взаимодействие WUS и системы CLAVATA

49 Экспрессия генов CLV1, CLV3 и WUS в апикальной меристеме побега Экспрессия WUS в ОЦ CLV1 «защищает» ОЦ от негативного влияния CLV3, связывая его

50 Рецепторные киназы растений c LRR–доменом (Leucine-rich repeat receptor kinases) Haffani et al., Can. J. Bot. 2004 Структура гена рецепторной LRR-рецепторной киназы

51 Эксперименты по выявлению новых компонентов сигнального пути, опосредованного CLV3 Получение новых мутаций на фоне сверхэкспрессии CLV3 coryne (crn) Muller et al., 2008 Известные рецепторы CV3 в ПАМ: CLV1 CLV2+CRN RPK2 CORYNE – рецепторная киназа с коротким внеклеточным доменом

52 TDIF CLV3 – член семейства CLE-пептидов В А Тип:

Участие CLE-пептидов в развитии Arabidopsis Jun J et al. Plant Physiol. 2010;154:1721-1736 ©2010 by American Society of Plant Biologists

54 Экспрессия CLE-пептидов в ПАМ

Стволовые клетки WUS ? 55 Каким образом WUS регулирует поддержание запаса стволовых клеток?

56 Yadav et al., 2011 Белок WUS мигрирует в вышележащие слои центральной зоны меристемы, где расположены стволовые клетки

57 WUS TAAT TAAT TAAT -1080 п.о. Активация транскрипции гена CLV3 Yadav et al., 2011 ТФ WUS связывается с промотором гена CLV3 и активирует его экспрессию WUS CLV3

58 WUS STM LFY Мишени ТФ WUS Создание трансгенных растений с регулируемой (индуцибельной) экспрессией WUS (WUS под контролем Et-OH-чувствительного промотора) alcR Транскрипционный фактор + Et-OH Гены, используемые как контроли Полномасштабный анализ экспрессии генов (microarray) у трансгенных растений с активацией WUS (при добавлении Et-OH)

Yadav et al., 2013 WUS негативно регулирует экспрессию генов многих ТФ, регулирующих дифференцировку клеток и развитие листа

60 Busch et al., 2010 Выявление мишеней ТФ WUS в транскриптомных исследованиях WUS CLV1 ауксиновый сигнальный путь цитокининовый сигнальный путь

61 WUS негативно регулирует экспрессию генов ARR А-типа (гены первичного ответа на цитокинин): -1000 по ARR7 WUS

WUS негативно регулирует экспрессию генов LOG, кодирующих цитокинин-активирующие ферменты Активность пролиферации клеток ПАМ зависит от баланса цитокининов и CLV3. В центре этой системы регуляции – ТФ WUS дикий тип дикий тип+ЦК мутант clv3 мутант clv3+ЦК

63 Биосинтез и сигнальный путь цитокининов: WUS WUS роль WUS в их регуляции

WUS STM AtIPT Цитокининовый ответ цитокинин Взаимодействие транскрипционных факторов STM и WUS и цитокининов 64 Ауксиновый ответ Гиббереллин GA20- оксидаза GA2- оксидаза

Роль гормонов в ПАМ 65

66 DR5:GFP Ауксины как регуляторы формирования листовых примордиев

Локальная экспрессия генов, кодирующих ТФ Локальное изменение концентрации гормона (или чувствительности клеток к действию гормона) в области экспрессии ТФ Распределение гормонов в растительном организме Модель взаимодействия ТФ и гормонов в развитии растений Изменение параметров роста растения

Эпигенетическая регуляция экспрессии WUS с участием факторов ремоделирования хроматина

fas1-1 fas2-1 wt wt Нарушение организации ПАМ у мутантов по генам FASCIATA FAS1 и FAS2 кодируют субъединицы комплекса CAF-1 - (CHROMATIN ASSEMBLY FACTOR-1) – шапероны гистонов H3/H4 Kaya et al., 2001

WUS CLV3 before just after 2 days after При выжигании зон экспрессии WUS или CLV3 они восстанавливаются в прилегающих клетках  существуют механизмы, определяющие экспрессию этих генов в определенной зоне

Зоны экспрессии генов в «модельной» меристеме Centering the Organizing Center in the Arabidopsis thaliana Shoot Apical Meristem by a Combination of Cytokinin Signaling and Self-Organization (Adibi et al. 2016)

72 Регуляции функции меристемы с участием сигналов от дифференцированных клеток дикий тип ham (hairy meristem) HAM HAM - транскрипционный фактор семейства GRAS ham (hairy meristem) – мутанты, характеризующиеся остановкой развития ПАМ и дифференцировкой меристематических клеток (клетки слоя L1 в клетки эпидермиса, нижележащие слои клеток – в клетки коры и проводящие ткани). Дифференцировка клеток меристемы Stuurman et al., 2002

Взаимодействие ТФ WOX и HAM в меристемах ТФ WOX и НАМ специфично взаимодействуют в меристемах: в АМ побега: WUS с HAM1 и HAM2 В АМ корня: WOX5 с HAM2 В камбии: WOX4 с HAM4 Zhou et al., 2015

Филлотаксис Золотое сечение (1,61803…) Золотой угол (137,5°…) – «золотое сечение» окружности

Модели филлотаксиса «Ауксиновая» модель «Механическая» модель MAP4 (Microtubule Associated Protein4):GFP

Giacomo et al., 2013 Взаимодействие факторов, регулирующих активность ПАМ

77 Регуляция клеточного цикла растений