Генетика микроорганизмов Вопросы лекции ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

Скачать презентацию Генетика микроорганизмов Вопросы лекции ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

Лекция 4.ppt

Количество слайдов: 43

Генетика микроорганизмов Вопросы лекции: • ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА У БАКТРИЙ • ВНЕХРОМОСОМНЫЕ ФАКТОРЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ: ПЛАЗМИДЫ, ТРАНСПОЗОНЫ, IS ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ • УМЕРЕННЫЕ И ДЕФЕКТНЫЕ ФАГИ • МОДИФИКАЦИИ, МУТАГЕНЫ, R S ДИССОЦИАЦИИ, РЕПАРАЦИИ • ГЕНЕТИЧЕСКИЕ РЕКОМБИНАЦИИ: ТРАНСФОРМАЦИЯ, ТРАНСДУКЦИЯ, КОНЬЮГАЦИЯ • ГЕНЕТИКА ВИРУСОВ • ОСНОВЫ ПОПУЛЯЦИОННОЙ ГЕНЕТИКИ 1

Молекулярная биология – изучает фундаментальные основы органической жизни Молекулярная генетика это генетика бактерий и бактериофагов. Основное значение установление механизмов передачи патогенных свойств и устойчивости к лекарственным препаратам 1865 – Г. Мендель: существование дискретных единиц наследственности генов 1869 Ф. Мишер впервые выделил ДНК 1928 Ф. Гриффитс осуществил трансформацию у бактерий 1953 Ф. Крик и Дж. Уотсон определили структуру гена 2003 Проект «Геном человека» успешно завершён: 99 % генома секвенировано с точностью 99. 99%. Обнародована полная последовательность генома человека. Функции гена: непрерывность наследования благодаря полуконсервативному механизму репликации ДНК. управление структурами и функциями организма с помощью генетичекого кода из четырех оснований: А (аденин), Т (тимин), Г (гуанин), Ц (цитозин). - эволюция организма благодаря мутациям и генетическим рекомбинациям. Этапы эволюции генетической системы: кодон ген оперон геном вирусов и плазмид хромосома прокариот (нуклеоид) хромосома эукариот (ядро). 2

Внехромосомные факторы наследственности Плазмиды: автономные (не связанные с хромосомой бактерии) интегрированные (встроенные в хромосому) Мигрирующие генетические элементы: Транспозоны Вставочные последовательности (IS элементы) Отличаются между собой по: молекулярной массе кодирующей емкости способности к автономному реплицированию Плазмиды выполняют функции: регуляторную и кодирующую. Регуляторная состоит в компенсации нарушений метаболизма ДНК клетки хозяина. Например, поврежденный бактериальный геном, не способный к репликации, функционально восстанавливается за счет плазмидного репликона. Кодирующая состоит во внесении новой информации, бактерии приобретают новый признак: • образованию пилей (F плазмида), • резистентности к антибиотикам (R плазмида), 5 • выделению бактериоцинов (col плазмида).

Переход плазмиды в автономное состояние связаны с индуцирующими воздействиями внешней среды. Продукты плазмидных генов могут способствовать выживанию бактерий (селективное преимущество). Самостоятельная репликация плазмидной ДНК способствует ее сохранению и распространению в потомстве. Встраивание плазмид происходит только в гомологичные участки ДНК. IS последовательностей и транспозонов встраиваются в любой участок ДНК. Виды плазмид: F плазмида (половой фактор) Мужские клетки (F+) содержат F плазмиду, женские (F—) – не содержат. Мужские клетки выступают в роли донора генетического материала при конъюгации, а женские – реципиента. Контролирует синтез половых ворсинок (sex или F-pili) способствуют конъюгации (спариванию бактерий доноров с реципиентными клетками) Перенос генетического материала (ДНК) детерминируется tra опероном F плазмиды (от англ. Transfer перенос). F плазмиду можно удалить (элиминировать) из клетки, обработав ее акридиновым оранжевым. Располагается в цитоплазме и может встраиваться в хромосому. 6

R плазмиды определяют устойчивость бактерий к лекарственным препаратам и чрезвычайно осложняют химиотерапию. Они имеют сложное молекулярное строение и включают: r ген, который содержит более мелкие мигрирующие элементы – IS-последовательности, транспозоны и tra опероны. r ген контролирует синтез фермента, вызывающего инактивацию или модификацию антибиотика. Многие r гены является транспозонами и перемещаются от плазмиды носителя в другие репликоны. В r гене может содержаться несколько транспозонов, контролирующих устойчивость к разным антибиотикам. Tra-оперон обеспечивает конъюгативность плазмиды, входит в состав R пламид грамотрицательных бактерий. Грам положительные бактерии содержат в основном неконъюгативные плазмиды, которые передаются путем трансдукции. 7

Плазмиды патогенности (tox плазмиды) контролируют вирулентные свойства бактерий и токсинообразование. Бактериоциногенные плазмиды контролируют синтез бактериоцинов, антибактериальных веществ способных вызывать гибель бактерий того же или близких видов. Бактериоцины обнаружены у кишечных бактерий (Co. L-плазмиды, колицины), бактерий чумы (пестицины), холерных вибрионов (вибриоцины), стафилококков (стафилоцины). Колицины – это вещества белковой природы более 25 типов, которые различаются по: физико химическим, антигенным свойствам, способности адсорбироваться на определенных рецепторах бактерий. Обозначаются латинскими буквами А, В, С, D, Е 1, Е 2, К и т. д. Механизм бактерицидного действия колицинов: после адсорбции на рецепторах наружной мембраны бактерий один из колицинов (ЕЗ) нарушает функцию рибосом, другой (Е 2) является ферментом эндодезоксирибонуклеазой. Колицины действуют и на цитоплазматическую мембрану бактерий. 8

Col плазмиды находятся в автономном состоянии и передаются при конъюгации без сцепления с хромосомой. Col. V, Col. B могут встраиваться в бактериальную хромосому (интегрированное состояние). Как и F плазмиды, передаются путем конъюгации благодаря имеющемуся у них trа оперону. • • Колицины могут губительно действовать на патогенные энтеробактерии, способствуя нормализации микробиоценоза. Определение типа колицинов используется: для типирования бактерий при эпиданализе заболеваний, определения типа Col плазмиды (колициногенотипирование), колицина патогенных бактерий (колицинотипирование) контактирующих от больных, из окружающей среды. Плазмиды биодеградации несут информацию об утилизации некоторых органических соединений источников углевода и энергии (лактоза, сахароза, раффиноза) и образовании протеолитических ферментов. Обеспечивают хозяину селективные преимущества в объектах окружающей среды и в организме человека. Например, урологические штаммы кишечных палочек содержат плазмиду гидролизации мочевины. 9

Транспозоны несут генетическую информацию, необходимую для транспозиции (нуклеотидные последовательности включающие от 2000 до 20 500 пар нуклеотидов). Находятся в свободном состоянии в виде кольцевой молекулы и могут существовать вне хромосомы (автономно), но неспособны к автономной репликации. Они реплицируются только в составе бактериальной хромосомы. При включении в бактериальную ДНК они вызывают дупликации, а при перемещении делеции и инверсии. Могут мигрировать в некоторые плазмиды и ДНК фагов, которые, проникая в бактериальные клетки, способствуют их распространению в популяции. Помимо генов, ответственных за транспозицию, они содержат и структурный ген. Транспозоны способны перемещаться по хромосоме. Их положение сказывается на экспрессии генов. 10

Выполняют регуляторную и кодирующую функции. Могут нести информацию: для синтеза бактериальных токсинов: ферментов, разрушающих или модифицирующих антибиотики. Транспозоны имеют особые концевые структуры нескольких типов, которые являются маркерами, позволяющими отличать их от других фрагментов ДНК. Их обнаруживают не только у бактерий и дрожжей, но и в клетках растений, насекомых, позвоночных животных и человека. Важнейшим свойством транспозонов является их способность к перемещению с одного репликона (хромосомная ДНК) на другой (плазмида) и наоборот. При интеграции транспозонов в хромосому клеток животных или человека они приобретают удивительное сходство с провирусами, находящимися в составе их хромосом. 11

ls-последовательности От (англ. Insertion вставка, sequence последовательность) представляют собой транспозируемые элементы, которые также называются «вставки последовательностей оснований» . Это фрагменты ДНК длиной 1000 пар нуклеотидов и более. В Is-последовательностях содержится информация, необходимая только для их транспозиции, т. е. перемещения в различные участки ДНК. Вследствие такого рода перемещений Is-последовательности могут выполнять ряд функций. 1. Координировать взаимодействие транспозонов, плазмид и умеренных фагов как между собой, так и с хромосомой бактериальной клетки и обеспечивать их рекомбинацию. 2. Вызывать инактивацию гена, в которой произошла интеграция ls-последовательности ( «выключение» гена), либо, будучи встроенными в определенном положении в бактериальную хромосому, служить промотором (участками ДНК, регулирующих экспрессию подлежащих структурных генов бактерий реципиентов), который включает или выключает транскрипцию соответствующих генов, выполняя регуляторную функцию. 12

Умеренные и дефектные фаги Факторами изменчивости бактерий могут быть умеренные или дефектные фаги, которые напоминают по своим свойствам плазмиды бактерий. Встраиваясь в хромосому, эти фаги вызывают лизогенизацию бактерий, которые могут приобретать новые признаки. Изменчивость лизогенных бактерий связана: • с приобретением генов, переносимых данными фагами от их предыдущих хозяев (бактерий доноров), • с экспрессией «молчащих» генов бактерий реципиентов. В последнем случае фаговая ДНК, встраиваясь вблизи поврежденного промотора, заменяет его. При этом синтезируются определенные продукты, например протоксины дифтерийных бактерий, ряда клостридий и др. 13

Модификация наследственно не закрепленные: морфологические (обратимые изменения форм) биохимические (индуцибельные ферменты) неспецифические – снижение активности, но таксономические признаки сохраняются специфические: синтез новых ферментов замещение метаболитов включаться в обменные процессы (L формы) Диссоциации стандартные проявления модификации в разделении однородной популяции. S колонии (гладкие) R колонии (шероховатые) признак неблагоприятных условий. 15

Мутации наследственно закрепленные, изменения первичной структуры, ошибки копирования Мутации – изменение генотипа, сохраняющееся в ряду поколений и сопровождающееся изменением фенотипа. Особенностями мутаций у бактерий является относительная легкость их выявления. Термин предложил де Фриз скачкообразные изменения Хромосомные новые признаки, более двух хромосом Генные один ген или цистрон Могут быть также и плазмидные мутации А. Спонтанные дикие неблагоприятные изменения, частота 1/107 Обратные мутации (реверсия) возврат к исходному с частотой 1 клетка/108 Б. Индуцированные Химические мутагены повышают частоту до 1 клетка/103 Физические мутагены – R , УФ , рентгеновское излучения Типы мутаций: Модификация оснований изменение отдельных нуклеотидов Вставка – включение дополнительных оснований Делеция – потеря одного или группы оснований 18 Деформация спирали ДНК

Рекомбинации – передача генетического материала по горизонтали между отдельными бактериями. Это обмен генетическим материалом между двумя особями с появлением рекомбинантных особей с измененным генотипом. А. Транформация – бактерия реципиент захватывает из внешней среды фрагмент чужеродной ДНК в фазу физиологической компетентности (log), когда аутолитические ферменты растворяют клеточную стенку на участке её синтеза (чаще у Грам+). Это состояние присуще активно делящимся клеткам, в которых идут процессы репликации собственных нуклеиновых кислот. В таких клетках действует фактор компетенции – это белок, который вызывает повышение проницаемости клеточной стенки и цитоплазматической мембраны, поэтому фрагмент ДНК может проникать в такую клетку. И происходит передача генетической информации в виде изолированных фрагментов ДНК при нахождении реципиентной клетки в среде, содержащей ДНК донора. 23

Условия, необходимые для успешной трансформации: • ДНК донора должна быть выделена из бактериальной культуры того же вида, что и реципиент(или близкородственного) • Участок трансформирующей ДНК должен сохранять двунитчатую суперспирализцию • Концентрация ДНК не должна быть малой или избыточной, в обоих случаях количество рекомбинантов снижается • Клетки-реципиенты должны быть компетентными, т. е. способными адсорбировать на своей поверхности ДНК донора и поглощать ее

Б. Трансдукция – перенос генетического материала от клетки донора клетке реципиенту с помощью умеренных бактериофагов. Неспецифическая – перенос случайного фрагмента ДНК (передаются разные гены, локализация трансдуцирующего фага непостоянна). Специфическая – перенос строго определенного фрагмента ДНК умеренным фагом (переносится всегда один и тот же ген, трансдуцирующий фаг всегда располагается в одном и том же месте). Абортивная фрагмент ДНК не встраивается в генофор реципиента, остается в цитоплазме. Результат – однолинейная наследуемость признаков. Переносимые признаки: 1. Синтез капсулы 2. Вирулентные свойства 3. Устойчивость к лекарственным средствам 4. Другие признаки 26

Неспецифическая трансдукция: - бактериофаг переносит любые гены донора; - неспецифическую трансдукцию осуществляют вирулентные фаги; - включение ДНК клетки-рецепиента (фиолетовая) при сборке фага носит случайный характер Основные этапы: § Адгезия на поверхности бактерии донора с последующим проникновением § Размножение бактериофага внутри клетки § Самосборка фаговых частиц и образование дефектного бактериофага (сохраняет инфекционные свойства и содержит какой либо фрагмент ДНК бактерии донора) § Перенос дефектным бактериофагом включенной ДНК в клетку реципиент § Рекомбинация и включение перенесенной ДНК в клетку рециент, а следовательно, изменение ее свойств

Специфическая трансдукция фаг переносит определенные гены от бактериидонора к бактерии-реципиенту Основные этапы: § Интеграция ДНК умеренного бактериофага в определенный участок хромосомы клетки донора § Захват соседних бактериальных генов (например, «gal» или «bio» ) при выходе из хромосомы § Формирование дефектного бактериофага (потерян фрагмент собственной ДНК фага, но захвачен фрагмент ДНК донора) § Перенос захваченного фрагмента ДНК донора в клетку реципиент § Включение его в геном клетки реципиента посредством рекомбинации

Конъюгация форма обмена генетическим материалом между бактериями при их непосредственном клеточном контакте. Необходимое условие : наличие в клеткедоноре трансмиссивной плазмиды. Процесс конъюгации у бактерий впервые был обнаружен Джошуа Ледербергом и Эдвардом Тейтумом в 1946 г.

Этот процесс контролируется F-плазмидами (Fфакторами), которые, находясь в цитоплазме клетки, могут реплицироваться автономно(F+ клетки), а могут быть интегрированы в бактериальную хромосому, тогда это Hfr штаммы Выщепляясь из бактериальной хромосомы, могут захватывать часть бактериальных генов и становиться автономными, тогда образуется F плазмида Доноры: F+ клетки ( «мужские» , содержат Fплазмиду ) Реципиенты: F клетки( «женские» , не содержат F-плазмиду )

Основные этапы: § § Прикрепление клетки-донора к реципиентной клетке с помощью половых ворсинок Образование между обеими клетками конъюгационного мостика Разрыв и деспирализация одной из нитей ДНК, проникновение проксимального конца в клеткуреципиент через конъюгационный мостик Достраивание второй нити ДНК в клеткереципиенте и восстановление ДНК-донора

Репарации Бактерии обладают специальными системами, восстанавливающими повреждения генетического материала репарационных, а сам процесс восстановления клеточного генома (ДНК) — репараций. Это обусловливает относительную стабильность их ДНК. Репарация поврежденной ДНК осуществляется ферментами, образование которых контролируется специальными генами. Функции многочисленных репаративных ферментов заключаются в установлении места повреждения ДНК, его «вырезании» , синтезе поврежденных фрагментов на матрице сохранившейся нити ДНК, ее встраивании в молекулу репарируемой нити ДНК. Одна из систем, восстаналивающая повреждения ДНК, вызванные УФ лучами, названа системой фотореактивации. Ферменты фотореактивации действуют в присутствии видимого света и осуществляют расщепление тиминовых димеров, превращающей их в мономерные формы. Активность другой системы, выполняющей эти же функции, обеспечивается ферментами, действующими в отсутствии видимого света. Это система темновои репарации, которую условно подразделяют на дорепликативную и пострепликативную. Повреждения ДНК, вызванные химическими мутагенами, также репарируются ферментами бактериальной клетки. 37

Генетика вирусов • • Геном вирусов содержит или РНК, или ДНК (РНК геномные и ДНК геномные вирусы соответственно). Выделяют: позитивную (плюс) РНК, обладающую матричной активностью и соответственно инфекционными свойствами негативную (минус) РНК, не проявляющую инфекционные свойства, которая для воспроизводства должна транскрибироваться (превращаться) в +РНК. Плюс нити функционально соответствуют и. РНК, т. е. способны транслировать закодированную генетическую информацию на рибосомы клетки хозяина, для минус нитевых РНК вирусов для трансляции необходим синтез комплементарной плюс цепи. Механизмы репродукции различных вирусов очень сложные и существенно отличаются. Основные их схематические варианты: 1. вирионная (матричная) +РНК комплементарная РНК (в рибосомах) вирионная +РНК. 2. РНК вирусная (информационная) +РНК (формируется на геноме зараженной клетки). 3. однонитевая ДНК: +ДНК ДНК +ДНК +ДНК. 4. ретровирусная однонитевая РНК: РНК ДНК (провирус) РНК. 5. двунитевая ДНК: разделение нитей ДНК и формирование на каждой комплементарной нити ДНК. 38

• Репликация как минус, так и плюс - нитей РНК осуществляется через репликативную (комплементарную исходной) форму РНК под действием РНК - зависимой РНК- полимеразы. • Репликативная форма РНК минус - нитевых вирусов (плюс - цепь) служит не только матрицей для синтеза дочерних вирусных РНК (минус - нитей), но и выполняет функции и. РНК, т. е. передает информацию на рибосомы и обеспечивает трансляцию (синтез вирусных белков). • У плюс - нитевых РНК- вирусов функцию трасляции выполняют ее копии, синтез которых осуществляется через репликативную форму (минус - нить) при участии вирусных РНК- полимераз. • У ретровирусов на матрице вирусной РНК при участии фермента обратной транскриптазы (ревертазы) образуется однонитевой ДНК транскриптант, на нем формируется двунитевой ДНК - провирус, с которого через образование и. РНК происходит реализация информации вирусного генома. 39

• У ДНК - вирусов репликация вирусной ДНК происходит при участии клеточной ДНК- полимеразы. У однонитевых ДНК вирусов вначале образуется комплементарная нить (репликативная форма), которая служит матрицей для дочерних молекул ДНК. • У двунитевых ДНК- вирусов происходит разделение нитей ДНК и формирование комплементарных нитей. • При участии ДНК- зависимой РНК- полимеразы синтезируются и. РНК, которые поступают на рибосомы клетки, где синтезируются вирусспецифические белки. • Генофонд вирусов создается и пополняется из четырех основных источников: • двух внутренних (мутации, рекомбинации) и двух внешних (включение в геном генетического материала клетки хозяина, поток генов из других вирусных популяций). 40

Фенотипическое смешивание при заражении клетки близкородственными вирусами с образованием вирионов с гибридными капсидами, кодируемыми геномами двух вирусов. Популяционная изменчивость вирусов связана с двумя разнонаправленными процессами мутациями и селекцией, связанными с внешней средой как индуктором мутаций и фактором стабилизирующего отбора. Гетерогенность вирусных популяций адаптационный генетический механизм, способствующий пластичности (устойчивости, приспособляемости) популяций, фактор эволюции и сохранения видов во внешней среде. Генофонд вирусных популяций сохраняется за счет нескольких механизмов: восстановления изменчивости за счет мутаций; резервирующих механизмов (возможность перехода любых, даже негативных мутаций в следующую генерацию) комплементация, рекомбинация; буферных механизмов (образование дефектных вирусных частиц, иммунных комплексов и др. ), способствующих сохранению вируса в изменяющихся внешних условиях. 41

ОСНОВЫ ПОПУЛЯЦИОННОЙ ГЕНЕТИКИ В организме человека бактерии находятся в виде популяций, локализующихся в определенных биотопах (полость рта, просвет кишки). Стабильность и выживаемость бактериальной популяции определяются ее генофондом, т. е. совокупностью генотипов всех составляющих ее микробных клеток. В процессе жизнедеятельности микробной популяции в ней появляются особи с измеренными признаками, которые являются гетерогенными по отношению к большинству клеток. Чем выше гетерогенность популяции, тем больше шансов на ее выживание. По мере накопления гетерогенных особей, имеющих селективные преимущества перед исходными клетками, изменяется генофонд популяции. Изменчивость генофонда микробной популяции может быть подразделена на два типа: фенотипическую — модификационную генотипическую — мутационно рекомбинационную. Модификационныи тип осуществляется с помощью постоянно действующих механизмов репрессии и индукции структурных генов, не сопровождающихся их перестройкой. Мутационно рекомбинационныи механизм связан с образованием в микробной популяции измененных генотипов, постоянно возникающих в результате мутаций, рекомбинаций, внесения внешней информации с 42 транспозируемыми элементами.

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ! 43