ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ Организация генетического аппарата хромосома плазмиды транспозоны

ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ Организация генетического аппарата: хромосома, плазмиды, транспозоны. Генотип и фенотип.

ЭТАПЫ ИССЛЕДОВАНИЙ В ОБЛАСТИ ГЕНЕТИКИ И ГЕНОМОВ 1865 – Gregor Mendel – фундаментальные основы наследственности 1884 -88 – O. Hertwig, E. Strasburger, A. vra Kolliber, A. Weisman – ядро клетки – основа наследственности 1909 – W. Johannsen – ввел термин “ген”, означающий передающуюся единицу с определенными свойствами 1910 – T. H. Mergan – открыл расположение генов на хромосоме дрозофилы 1944 – O. T. Avery, C. M. Macleol, M. Mo. Carty – ДНК - носитель наследственности 1950 – E. Chargaff – 4 основания (A+C; G+T) составляют основу ДНК 1951 – R. Franklin – первый рентгеноструктурный анализ ДНК 1953 – Y. Watson, F. Crick – описана модель двуспиральной молекулы ДНК 1961 – M. Nirenberg – генетический код 1965 – H. Mathaei, S. Ochoa –каждая из 20 аминокислот имеет свои три буквы оснований 1977 – W. Gilbert, A. Maxam, F. Sanger – метод секвенирования 1982 – первый рекомбинантный инсулин (США) 1983 – K. Mullins – разработал метод ПЦР 1986 – открыт первый ген, ответственный за амиотрофию 1988 – принято решение (США и Япония) секвенировать геном человека 1990 – начало Международного проекта “Геном человека” 2000 – C. Venter, F. Collins – полный сиквенс генома человека 2002 – полный сиквенс генома мыши

Молекулярная организация генома микроорганизмов • ХРОМОСОМА ––––––––––––– - большая молекула НК (ДНК, РНК, дву- или одноцепочечная), содержащая генетическую информацию о стратегии патогена (множество генов: у бактерий - 800 -4000; вирусов - 1 -300); • ГЕН ––––– - фрагмент НК (ДНК, РНК), кодирующий белок • Одноцепочечная ДНК ––––– - цепь ДНК, состоящая из нуклеотидов • НУКЛЕОТИДЫ ––– ––– - нуклеотид включает три компонента: 1. Основание -- О (A, T, G, C) 2. Фосфат -- Р 3. Сахар -- С (рибоза, дезоксирибоза) –––

Молекулярно-генетические основы эволюции микроорганизмов § Мутации § Генетические рекомбинации конъюгация, трансдукция, трансформация, транспозиция, реассортация § Селекция ГЕНЫ ЭВОЛЮЦИИ § § § гены локусов патогенности; модульная мультилокусная структура некоторых геномов повторяющиеся сегменты (тандемы) ДНК, ответственные за адаптивность: ДНК-связывающий мотив факторов транскрипции § митохондриальные генетические элементы (криптогены) § гипервариабельные участки ДНК и РНК микроорганизмов § внехромосомные генетические элементы (плазмиды, транспозоны) Перестройка генома - ключ к изменению функции клетки и соответственно патогенности

Взаимодействие генотипа с окружающей средой ГЕНОТИП - Наследственная предрасположенность к атопии, астме - Гиперотвечаемость бронхов, кожи, ЖКТ - Гены, аллели генов Предболезнь или начальные стадии аллергических заболеваний ОКРУЖАЮЩАЯ СРЕДА (включая производственную) - внутриутробное влияние микроэкологии материнских факторов; - аллергены - экзогенные; - инфекции (вирусные, грибковые, бактериальные, паразитарные) - курение - пищевые аллергены - лекарственные аллергены - производственные Клинический фенотип аллергического заболевания (изменение структуры и функции органа мишени) иммунозависимое воспаление

ГЕНОМ МИКРООРГАНИЗМОВ § § § § наименьших вирусов содержит только три гена, соответственно кодирует 3 белка; наибольших – более 200 -300 генов, кодирующих множество структурных и неструктурных белков, ферментов; большинство вирусов содержит до 50 генов; предполагается, что на каждые 1000 пар оснований (bp) существует 1 белок; типичный ген детерминирует полипептид, состоящий из 300 -400 аминокислот (т. е. 1000 bp или 1 kbp); геном вируса 5000 bp или 5 kbp; геном бактериофаг Т 4 = 200 kbp, кодирует примерно 150 -200 белков; геном E. coli равен 4000 kbp и кодирует около 4000 белков, подавляющее большинство которых не изучено

Геномы некоторых вирусов человека Тип вируса Calicivirus Denque virus Ebola virus Hepatitis A virus Hepatitis B virus Hepatitis C virus Hepatitis D virus Hepatitis E virus Human coronavirus Human echovirus 1 Human enterovirus 1 Human herpes virus Размер генома (bp) 74536 10703 18959 7478 3215 9646 1682 7176 27317 7347 7389 152261 Год секвенирования 2002 1993 1999 1998 1987 2002 1993 2001 1998 1993 1990

Геномы некоторых вирусов человека (продолжение) Тип вируса HIV-1 HIV-2 Influenza A virus Measles virus Mamps virus Norwalk virus Polivirus Rabies virus Rubella virus Tick born encephalitis Variola virus West Nile virus Размер генома (bp) 9181 10359 2341 15894 15384 7654 7440 11932 9755 11141 185578 10962 Год секвенирования 2003 2002 1998 2000 2002 1993 2003

СИКВЕНС ГЕНОМА МЫШЕЙ § полный сиквенс в декабре 2002 г; § 30 000 генов; § 99% генов полностью идентичны генам человека § Сравнительный анализ: - - возможность манипулировать каждым геном; возможность узнать функцию; мыши с нокаутом генов; мыши с иммунной системой человека

ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА И ИММУННАЯ СИСТЕМА (ИС) Ø примерно 36 000 генов; Ø только 300 генов отличают от мышей; Ø около 40% генома ассоциируются с факторами ИС; Ø гены ИС наиболее мутабельные (т. е. изменчивые); ( Ø гены ИС - это гены адаптации к изменениям внешней среды; Ø гены ИС - часто дефектны. Известно более 90 генетических дефектов. Установлена их хромосомная локализация;

ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА МИКРООРГАНИЗМОВ -БАКТЕРИИ- 23 пары хромосом 36 000 генов 1 хромосома 2, 0 -4, 0 тыс. генов -ВИРУСЫДНК- и РНК-нити 1 -200 генов МУТАЦИИ И РЕКОМБИНАЦИИ • Защита или • • предрасположенность к инфекции Снижение иммунного надзора (онкогенез) Иммунопатология: - аллергия - аутоиммунные б-ни - иммунодефициты • Новые варианты • Повышение • • вирулентности Увеличение резистентности к антибиотикам Изменение антигенной структуры

ОБЩАЯ СХЕМА РАЗВИТИЯ ИММУНОПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ПРОВОЦИРУЮЩИЕ ФАКТОРЫ Т-КЛЕТКИ Иммунотропные факторы (биологические микроорганизмы, физические, химические) АПК ТКР HLA гены Антиген (ауто. Аг) ИММУННАЯ СИСТЕМА МАКРООГРАНИЗМА / или / Т-КЛЕТКИ Kлоны CD 4+ и CD 8+ Тклеток Цитотоксичность и воспаление (цитокины) Гены В-КЛЕТКИ ЛОКАЛЬНОЕ ИЛИ СИСТЕМНОЕ ВОСПАЛЕНИЕ Гены АПОПТОЗ КЛИНЧЕСКАЯ ФОРМА ЗАБОЛЕВАНИЯ Aллергены Аутоантигены Гены клоны В-клеток Цитотоксичность и воспаление (аутоантитела+ комплемент) ПОВРЕЖДЕНИЕ ТКАНЕЙ

Формирование патологии в результате дефектов одного или нескольких генов а. Единичная патология гена Генотип 1. Ген А 2. Мутантный ген А 3. Исправленный ген А Биосинтетический продукт (+) (-) (+) Результат Норма Болезнь Норма б. Множественная патология гена 1. Ген А (+) Ген В (+) 2. Мутантный ген А (-) Ген В (+) 3. Исправленный ген А (+) Ген В (+) 4. Мутантный ген А (-) Сверх-экспрессированный ген В (+) Норма Болезнь Норма

ГЕНОМИКА И ПРОТЕОМИКА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЧЕЛОВЕКА (теоретические и прикладные направления)

+Геномика (genomics) – новое направление генетики, изучающее геном, отдельные гены на молекулярном, индивидуальном и популяционном уровнях, взаимосвязи между генами и их эволюцию; механизмы экспрессии и регуляции, возможности их переноса в другие системы, клонирование, использование в генно-инженерных целях +Транскриптомика – изучает транскриптомы, т. е. все молекулы РНК, образующиеся в клетке, тканях и органах.

НАПРАВЛЕНИЯ ГЕНОМИКИ 1. Структурная – секвенирование гена(-ома), определение границ генов (открытых рамок считывания; регуляторных элементов и “горячих точек” рекомбинации (промоторы, энхансеры) 2. Функциональная – идентификация функции каждого гена и каждого его участка; определение их роли в детерминировании признаков; обеспечении жизнедеятель -ности организма 3. Эволюционная (сравнительная) – “обратная генетика” – от признака к гену и их использование для таксономических целей; выявление родственных связей между разными организмами

Происхождение субклеточных форм биологической жизни

Этапы изучения ДНК и практическое использование данных о ее строении Годы Исследователи и открытия 1869 Frederich Miesher – открытие ДНК в гное инфицированной раны 1941 Beadle Tatum – догма: один ген – один белок 1944 Avery – ДНК – генетический материал 1953 Watson и Crick – двуспиральная ДНК 1958 Meselson и Stahl – ДНК реплицируется полуконсервативно 1961 Jacob и Monool – модель оперона в регуляции гена 1970 Temin и Baltimore – обратная транскрипция у ретровирусов 1977 Секвенирование ДНК, структура генов 1981 Каталитические РНК; трансгенные животные 1987 Kary Klullis – полимеразная цепная реакция 1990 Полный сиквенс вируса простого герпеса

Хромосомная локализация генов, предрасполагающих к Астме и Аллергии § 5 q хромосома: - уровень Ig. E - уровень противовоспалительных цитокинов (ИЛ-3 -5, 9, 13, ГМ-КСФ) - рецепторы: * 2 - адренергический; * Глюкокортикостероидный § 6 р хромосома: - гены иммунного ответа - аллели HLA системы - С 2 и С 4 и фактор В - комплотипы - аллели ФНО § 12 q хромосома: - NO синтетаза § 14 q хромосома - альфа цепь ТКР - иммунный ответ § 16 р хромосома - рецептор ИЛ-4 § 19 q хромосома - трансформирующий фактор бета

Гены С 5 компонента и аллергия § С 5 -дефектные мыши чувствительны к аллергии; § блокирование рецептора С 5 а снижает продукцию ИЛ-12; § отсутствие С 5 повышает ответ Th 2 -типа; § хромосома 19 q содержит гены C 4 a. R

Идентификация генов, повышающих чувствительность к аллергическим заболеваниям § выявлено множество генов; § отдельный ген оказывает очень малый эффект; § каждый из генов кандидатов взаимодействует с другими генами на хромосоме (не в аддитивном режиме); § сегрегация генов не зависима; § велика роль факторов окружающей среды

ПРЕИМУЩЕСТВА МЫШИНОЙ МОДЕЛИ § возможность моделировать условия окружающей среды (радиация, химические соединения, аллергены); § можно иммунизировать; § можно тестировать одновременно много фено- и генотипов; § быстро размножаются – анализ потомства (мутации); § можно секвенировать гены; § имеется база данных генома (для сравнения)

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА 1. Гель-электрофорез 2. Ауторадиография 3. Электронная микроскопия 4. Гибридизация ДНК и РНК 5. Иммунофенотипирование 6. Southern, Northern и Western блоттинг м п м п ДНК+РНК РНК+ДНК белок антитела 7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР раннего времени) 8. Молекулярные чипы – Microarray analysis

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ ГЕНОВ Секвенирование Клонирование (ПЦР, DNA microarray) Идентификация генов Экспрессия генов Мишень для скрининга лекарств, поиска новых Ассоциация с клинической формой болезни Генодиагностика Фармакогенетика

Примеры дегенеративных заболеваний разных тканей и органов, которые можно лечить трансплантацией стволовых клеток Кровь Лейкемия Серповидно-клеточная анемия Спинной мозг Повреждение позвоночника Мозг Паркинсонизм Б-нь Альцгеймера Сердце Заболевания сердца Мышцы Мышечная дистрофия Кожа Поджелудочная железа Ожоги Диабет Печень Цирроз печени Костная и хрящевая ткани Артриты, остеопороз травмы

+Протеомика – научное направление, изучающее закономерности функционирования отдельных белков или определенной совокупности белков клетки в конкретный период ее развития, характер и последствия их биологических взаимодействий, роль в регуляторных и эффекторных процессах. Белковый продукт вирусов и бактерий, белок -белковые и белок-нуклеиновые взаимодействия, экспрессия белков и ее регуляция

+Биоинформатика – направление биологии, основанное на компьютерном анализе “in silico” первичной структуры молекул ДНК, молекул РНК и белков (т. е. их полных сиквенсов или сиквенсов их фрагментов). Для этого используются специальные компьютерные программы и информационные базы данных

БАЗЫ ДАННЫХ § Журнал – Nucleic Acids Research § База данных ДНК (Gen Bank, DNA Databank of Japan) § База данных Европейская лаборатория молекулярной биологии (EMBL) genomik. sanger. ac. uk § PFAM – база данных семейств белков § PRINTS – база данных белковых мотивов § Pro. Dom – коллекция белковых доменов § SMART – коллекция белковых доменов § BLOCKS – база данных консервативных областей белков

Молекулярная филогенетика (эволюция) Два способа представления взаимосвязей (различий, родственности)

Взаимосвязь между размером генома и паралоgues Organism Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli Haemophilus influenzae Mycoplasma genitalium Genome size relative to E. coli Percentage of proteins belonging to paralogues 1. 4 1 75 50 0. 38 35 0. 12 26

Сравнительная геномика – практические аспекты Kato-Maeda et al (2001) проанализировали сиквенс 19 штаммов Micobacterium tuberculosis Выводы: - Все штаммы имеют примерно 0, 3% делеций в геноме; - Большинство из утраченных фрагментов ДНК относились к предковым генам, функция которых не востребована в течение долгого периода (гены, связанные с фагами, isэлементы); - При увеличении делеций снижалась вирулентность бактерий (т. е. способность вызывать кавернозную форму ТБ)

Сравнение геномов микобактерий Характеристика M. tuberculosis M. leprae Размер генома G+C (%) Кодирование белков (%) 49, 5 Количество генов, кодирующих белки 1604 Псевдогены Плотность генов (bp/ген) 2037 Средняя длина гена (bp/ген) Средняя длина неизвестных генов 338 3268203 57, 79 90, 8 4411532 65, 61 3959 1116 6 1114 1011 1012 653

Геномические подходы к созданию вакцин Секвенирование генома Протеолитические технологии in silico анализ мутагенез ДНК макроаррэй клонирование и экспрессия Исследования in vito и in vivo для идентификации штаммов, кандидатов в вакцины