ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ И ЕЕ РОЛЬ В МЕДИЦИНЕ к

ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ И ЕЕ РОЛЬ В МЕДИЦИНЕ к. м. н. , доц. Перунова Н. Б. 2011

Основные открытия общей генетики хромосомальная теория наследственности Томас Хант Морган (1933) открытие появления мутаций под влиянием рентгеновского облучения Герман Джозеф Мёллер (1946) исследования нуклеотидов и нуклеиновых кислот Александер Робертус Тодд (1957)

роль генов в специфических биохимических процессах «один ген — один фермент» Джордж Уэлс Бидл, Эдуард Тейтем (1958) генетическая рекомбинация и организация генетического материала у бактерий Джошуа Ледерберг (1958) механизм биологического синтеза рибонуклеиновой и дезоксирибонуклеиновой кислот Северо Очоа и Артуру Корнбергу (1959)

С 1933 г. Нобелевская премия присуждалась в 17 раз 1989 г. — Сиднею Альтману и Томасу Чеку за открытие каталитической функции РНК и применение этой функции в биотехнологии

Геном бактерий состоит из генетических элементов, способных к самостоятельной репликации (РЕПЛИКОНОВ) РЕПЛИКОНАМИ ЯВЛЯЮТСЯ ХРОМОСОМА И ПЛАЗМИДЫ

ГЕНОМ МИКРОБНОЙ КЛЕТКИ БАКТЕРИАЛЬНАЯ ХРОМОСОМА (ФОРМИРУЕТ КОМПАКТНЫЙ НУКЛЕОИД) ГЕНОТИП (ДНК – В НУКЛЕОИДЕ) кодирует жизненно важные функции ПЛАЗМИДА (ВНЕ ХРОМОСОМЫ) ПЛАЗМОТИП (ДНК В ЦИТОПЛАЗМЕ) дает преимущества при попадании в неблагоприятные условия устойчивости патогенности

Хранение наследственности – в форме последо-вательности нуклеотидов ДНК Каждому белку соответствует свой ген (дискретный участок на ДНК) Совокупность генов – геном (определяется количеством н. п. ) Геном имеет гаплоидный набор генов Бактериальная хромосома – чаще кольцевая двухцепочечная ДНК Размер хромосом варьирует

ПЛАЗМИДЫ Под строгим контролем – репликация сопряжена с репликацией хромосомы (одна или несколько копий) Под слабым контролем – репликация не сопряжена с репликацией хромосомы (от 10 до 200 копий)

СВОЙСТВА ПЛАЗМИД Нуклеиновая природа (ДНК) Автономность размножения (эписома) Кодирование свойств бактерий (Col, R, ALA и др. ) Регуляция функции генов хромосомы Интеграция в хромосому Сообщает клетке свойство донора Сообщает клетке иммунитет к суперинфекции Трансмиссивность - инфекционная природа

ВИДЫ ПЛАЗМИД Эписомы (интегративные) Обратимо встраиваются в хромосому Коньюгативные (трансмиссивные) присущи крупным плазмидам, имеющим traоперон Мобилизуемые мелкие плазмиды без tra- оперона (передаются в присутствии трансмиссивных плазмид)

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ПЛАЗМИД Генотип Фенотип Свойства f+ profag+ F-фактор Профаг r+ col+ Бактерио- R-фактор циногенный фактор ala+ АЛА ЛА - Механизм - Лизогения -Множествен- формирова- Пол бактерий персисная устойчи- Конъюгация Фаговая ния микроб- тенции (Нfr-фактор) конверсия вость к анти- ного биоцебактерий биотикам ноза - Генная Применение инженерия (Картирование хромосом) - Метод химиотерапии (Индукция лизогении) - Выявле- - Профилакние госпи- тика и терапия тальных дисбиозов штаммов - Эпидметка - Механизм формирования микробного биоценоза - Диагностика и терапия персистент- болезней ных форм микробной инфекции этиологии

ГРУППЫ ГЕНОВ БАКТЕРИЙ ГЕНЫ РОСКОШИ индуцибельные гены (luxury genes) функционируют на определенных этапах онтогенеза или при попадании клетки в определенные условия (гены лактозного оперона у некоторых бактерий, активирующиеся) при дефиците глюкозы и наличии лактозы в среде ГЕНЫ «ДОМАШНЕГО ХОЗЯЙСТВА» постоянно экспрессирующиеся гены (housekeeping genes) кодируют самые необходимые белки, осуществляющие основные биохимические процессы

housekeeping genes кодирующие т. РНК, р. РНК ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы Ферменты гликолиза белки рибосом и т. д.

Набор минимально необходимых для автономной жизнедеятельности генов «генов домашнего хозяйства» - постоянен для всех клеток и составляет 256 генов. Размер генома различных видов микроорганизмов определяется количеством необязательных, факультативных генов - «генов роскоши» и характеризует спектр адаптационного потенципала.

ПОДВИЖНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭЛЕМЕНТЫ ПГЭ могут находиться как в составе хромосомы, так и в составе плазмид Вставочные (инсерционные) последовательности IS-элементы - перемещаются (из одного участка репликона в другой и между репликонами) - размер 1000 н. п. - содержат гены необходимые для их перемещения (транспозаза , репрессор) Транспозоны - обладают теми же свойствами, что IS-элементы + имеют структурные гены (синтез молекул со специфическим биологическим свойством)

ПРИ ПЕРЕМЕЩЕНИИ ПГЭ: инактивация участков ДНК в месте встраивания образование повреждений генетического материала клетки слияние репликонов (встраивание плазмиды в хромосому) распространение генов в популяции → изменение биологических свойств популяции → эволюционный процесс

ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ БАКТЕРИЙ: ПГЭ ИНТЕГРОНЫ

ИНТЕГРОНЫ Система захвата малых элементов ДНК (генные кассеты) посредством сайтспецифической рекомбинации и их экспрессии Кассета в 2 -х формах линейная и кольцевая Интегрон состоит из консервативного участка (кодирует интегразу) Интеграза осуществляет рекомбинацию, включая гены кассеты в интегрон Интеграция обратимый процесс Перемещение внутри одной клетки и популяции бактерий

ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ БАКТЕРИЙ: трансформация трансдукция коньюгация

ОСТРОВА ПАТОГЕННОСТИ: Участки ДНК отличающиеся составом Г-Ц н. п. Протяженность не более 10 000 н. п. Ответственны за синтез факторов патогенности По флангам прямые повторы ДНК и ISэлементы Могут входить в составе плазмид

ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ: I. МУТАЦИИ изменение нуклеотидов → изменение фенотипа спонтанные (самопроизвольно) перемещение ПГЭ индуцированные (извне) действие мутагенов -физические (радиация, УФЛ) -химические (азотистая кислота) -биологические (транспозиция – замена на аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований)

II. РЕКОМБИНАЦИИ взаимодействие между 2 -мя ДНК (с разным генотипом) → рекомбинантная ДНК (гены обоих родителей) гомологичная рекомбинация (обмен между участками ДНК с высокой степенью гомологии) сайтоспецифическая рекомбинация (встраивание плазмиды в хромосому – взаимодействие между идентичными IS-элементами хромосомы и плазмиды) незаконченная (репликативная) рекомбинация (транспозиция ПГЭ, сопровождаемая репликацией ДНК) РЕКОМБИНАЦИЯ – КОНЕЧНЫЙ ЭТАП ПЕРЕДАЧИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ АДАПТАЦИЯ БАКТЕРИЙ ! ! !

ЦЕЛЬ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ В МИКРОБИОЛОГИИ: ДИАГНОСТИКА: идентификация возбудителя (I принцип - экспресс метод, бактериологический метод) ЛЕЧЕНИЕ (генная инженерия) ПРОФИЛАКТИКА (типирование штаммов)

МЕТОДЫ ДНК-ДИАГНОСТИКИ: ММГ (метод молекулярной гибридизации) ПЦР (полимеразная цепная реакция) ЛЦР (лигазная цепная реакция)

MMГ основан на обнаружении нуклеиновых кислот с помощью гибридизационных зондов. Основой метода является соединение искомой нуклеиновой кислоты с меченым зондом через комплементарные участки ДНК

Преимущества и недостатки ММГ + Относительная легкость интерпретации результатов + Возможность одновременной детекции многих фрагментов ДНК (биочипы) - Многоэтапность - Более низкая чувствительность по сравнению с ПЦР - Техническая сложность и высокая стоимость

ПЦР

Преимущества и недостатки ПЦР + высокая специфичность + универсальность процедуры выявления возбудителей + высокая чувствительность + возможность проведения не только качественной, но и количественной оценки содержания н. к. + высокая скорость + диагностика латентных инфекций - оснащение лаборатории - получение ложноположительных результатов - не используется для диагностики оппортунистических инфекций - чувствительность к мутациям

ЛИГАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ Метод использует способность ДНК лигазы соединять две пары комплементарных олигонуклеотидов после их гибридизации с последовательностями ДНК мишени in vitro.

Преимущества и недостатки ЛЦР + чувствительность и специфичность, сопоставимы с ПЦР + чувствительность при обнаружении точечных мутаций - чувствительность к мутациям в области лигируемых нуклеотидов - техническая сложность и высокая стоимость

ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ И ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ

Биотехнология – это область человеческой деятельности, которая характеризуется широким использованием биологических систем всех уровней в самых разнообразных отраслях науки, промышленного производства, медицины, сельского хозяйства и других сферах.

К основным разделам современной биотехнологии относятся: микробиологический синтез, клеточная инженерия и генная инженерия. КЛЕТКИ БАКТЕРИЙ – БИОФАБРИКИ! ВЫРАБОТКА РАЗНООБРАЗНЫХ ПРОДУКТОВ (БЕЛКИ, ЖИРЫ, УГЛЕВОДЫ, ВИТАМИНЫ, ГОРМОНЫ, ФЕРМЕНТЫ, СПИРТЫ И ДР. ) • БЫСТРО ВОСПРОИЗВОДЯТСЯ • ЭКОНОМИЧНО •

БИОТЕХНОЛОГИЯ ИСПОЛЬЗУЕТ: Сами клетки как источник целевого продукта Крупные молекулы, которые синтезируются клетками в процессе выращивания (ферменты, токсины, антигены и др. ) Первичные метаболиты – низкомолекулярные вещества (аминокислоты, витамины, нуклеотиды и др. ) Вторичные метаболиты (идиолиты) – низкомолекулярные и макромолекулярные соединения (антибиотики, алколоиды, гормоны и др. )

Генная инженерия представляет собой совокупность методов, позволяющих создавать синтетические системы на молекулярно- биологическом уровне. ГИ возникла в 1972 г. , когда в лаборатории П. Берга (Станфордский ун-т, США) была получена первая рекомбинантная (гибридная) ДНК

Методы генной инженерии основаны на получении фрагментов исходной ДНК и их модификации. Для получения исходных фрагментов ДНК разных организмов используется несколько способов: Получение фрагментов ДНК из природного материала путем разрезания исходной ДНК с помощью специфических нуклеаз (рестриктаз). Прямой химический синтез ДНК, например, для создания зондов (молекулы ДНК с заранее известной структурой, в состав которых входят радиоактивные изотопы фосфора или водорода). Синтез комплементарной ДНК (к. ДНК) на матрице м. РНК с использованием фермента обратной транскриптазы (ревертазы).

Выделенные участки ДНК встраивают в векторы переноса ДНК. Векторы – это небольшие молекулы ДНК, способные проникать в другие клетки и реплицироваться в них. В состав вектора входит не менее трех групп генов: Гены, которые интересует экспериментатора. Гены, отвечающие за репликацию вектора. Гены-маркеры, по деятельности которых можно судить об успешности трансформации (например, гены устойчивости к антибиотикам или гены, отвечающие за синтез белков, светящихся в ультрафиолетовом свете).

Способы прямого введения генов в клетку Трансфекция (метод термошока) Микроинъекция (позволяет вводить любую ДНК, не требуется селективного давления) (Андерсон и Диакумакос, 1970) Электропорация (импульсы высокого напряжения обратимо увеличивает проницаемость биомембран) Упаковка в липосомы Биологическая баллистика (на мельчайшие частички вольфрама, диаметром 0, 6— 1, 2 мкм, напыляется ДНК вектора)

Часто в качестве реципиентов используют: E. coli, B. subtilis, псевдомонады, нетифоидные серовары сальмонелл, дрожжи, вирусы В настоящее время созданы: Вакцина против гепатита В Интерлейкины -1, 2, 3, 6 Инсулин Гормоны роста Интерферон α, β, γ Эритропоэтин Антигены ВИЧ И другие………….

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!

ГЕНОТИП – ФЕНОТИП (генетический контроль вирулентности Множественная устойчивость к антибиотикам r Пили общего типа Фактор адгезии Е. coli Энтеротоксин Е. coli cfa-1 tox Гиалуронидаза pil hia pro. A tox Плазмида Хромосома cap pro ch Протеаза холерогена Фактор Протоксин пенетрации холероген Sh. sonnei холероген tox d tox eri ope Эритрогенный profag токсин Протеин А pro. M pen tox ch Нейраминидаза nei Протеин М Капсула Дифтерийный токсин

ГЕНЕТИКА БАКТЕРИЙ ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ ДИАГНОСТИКА ЛЕЧЕНИЕ Обнаружение атипичных форм возбудителя (L-формы и др. ) ПРОФИЛАКТИКА Преодоление антибиотикорезистентности Генетические методы: Создание ДНК-гибридизация, ПЦР и др. эубиотиков Создание искусственных вакцин Генноинженерные Геносистематика ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ Генные

ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ РЕКОМБИНАЦИИ Конъюгация МУТАЦИИ Трансформация Трансдукция Спонтанные Индуцированные ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ИЗМЕНЧИВОСТИ АДАПТАЦИИ ДИССОЦИАЦИИ ПОПУЛЯЦИОННЫЙ АНАЛИЗ СЕЛЕКЦИЯ КЛОНОВ