ГЕНЕТИКА МІКРООРГАНІЗМІВ Історія розвитку

ГЕНЕТИКА МІКРООРГАНІЗМІВ

Історія розвитку генетики Рік Подія 1917 Карл Ереки ввів термін “біотехнологіяі” 1944 Евері, Мак. Леод, Мак. Карті довели, що генетичним матеріалом є ДНК 1953 Уотсон і Крик розшифрували структуру ДНК 1970 Виділена перша рестриктуюча ендонуклеаза 1973 Бойєр, Коен заклали основи технології рекомбінантних ДНК (гібрид фагу λ і E. coli) 1978 Отримано перший людський інсулін 1982 Перша вакцина для тварин 1988 Створено метод ПЛР (полімеразна ланцюг. р-ція) 1990 Почато роботу над проектом “Геном людини”

F. Crick i J. Watson – відкривачі структури ДНК

Ріст та генетичний апарат бактерій

На відміну від багатоклітинних організмів, в одноклітинних організмах ріст та розмноження (поділ клітини) тісно пов'язані. Бактерії доростають до певного розміру, після чого проводять процес поділу, форму безстатевого розмноження.

За оптимальних умов бактерії можуть рости та ділитися надзвичайно швидко, до одного поділу кожні 9, 8 хвилин для певних видів бактерій. При поділі клітини створюються дві генетично ідентичні дочірні клітини. Деякі бактерії, хоча теж розмножуються безстатево, формують складніші відтворюючі структури, які полегшують поширення нових дочірніх клітин.

Приклади включають створення плодових тіл міксобактеріями, створення повітряних гіф представниками роду Streptomyces та брунькування.

Міксобактерії

Брунькування означає формування виступу, який пізніше відокремлюється, формуючи окрему клітину.

У лабораторних умовах бактерії зазвичай вирощують, використовуючи тверде або рідке середовище. В якості твердого середовища використовуються чашки Петрі із шаром агару, що містить поживні речовини. Такі чашки використовуються для отримання штамів бактерій. Проте, рідке середовище зазвичай викортовується для вимірювання швидкості росту або отримання визначених об'ємів клітин. Інколи використовуються відбірні середовища, (середовища з додаванням антибіотику) для виділення та ідентифікації окремих штамів бактерій.

Більшість лабораторних методів зростання використовують високі рівні поживних речовин для отримання великих кількостей клітин. Проте в природних умовах кількість поживних речовин обмежена, що означає, що бактерії не можуть розмножуватися нескінченно. Це обмеження призвело до створення бактеріями різних стратегій зростання. Деякі організми можуть рости надзвичайно швидко, коли поживні речовини стають доступними, наприклад, формування цвітіння води (за рахунок росту клітин ціанобактерій), які часто відбуваються в озерах улітку.

Багато організмів адаптуються до бідних та агресивних оточень, наприклад, шляхом виробництва антибіотиків представниками роду Streptomyces та іншими, тим самим не даючи рости конкуруючим мікроорганізмам. Часто бактерії співпрацюють, формуючи біоплівки та змінюючи швидкість росту завдяки відчуттю кворуму. Ці взаємини можуть бути істотними для зростання всієї групи організмів (синтрофія).

Ріст бактерій звичайно включає три фази. Коли популяція бактерій потрапляє до багатого на поживні речовини оточення, яке дозволяє зростання, клітинам потрібний певний час, щоб пристосуватися до нового оточення. Перша фаза росту, фаза повільного росту, є фазою такого пристосування. Ця фаза характеризується високою швидкістю біосинтезу ферментів і активного транспорту. За нею слідує фаза експоненціального росту, що характеризується швидким експоненціальним зростанням кількості бактерій. Швидкістю зростання вважається час подвоєння бактерій протягом цієї фази. Остання фаза росту — стаціонарна фаза, що спричинена виснажуванням поживних речовин. Клітини скорочують свою метаболічну діяльність і споживають неістотні клітинні білки. Стаціонарна фаза — це перехід від швидкого зростання до стресового стану, що характеризується збільшенням експресії генів, що беруть участь у ремонті ДНК та антиоксидантному метаболізмі.

Спори та неактивні форми бактерій Типи морфології ендоспор. 1, 4 - центральна ендоспора, 2, 3, 5 - термінальна ендоспора, 6 - бічна ендоспора Спороутворення — НЕ спосіб розмноження

Деякі бактерії типу Firmicutes здатні формувати ендоспори, що дозволяють їм витримати екстремальні екологічні і хімічні умови (наприклад, грам-позитивні Bacillus, Anaerobacter, Heliobacterium та Clostridium). Майже у всіх випадках формується одна ендоспора, тобто це не є процесом відтворення, хоча Anaerobacter може формувати до семи ендоспор на клітину.

Ендоспори мають центральне ядро, складене з цитоплазми, що містить ДНК та рибосоми, оточене кірковим шаром і захищене непроникною і жорсткою оболонкою.

Ендоспори не здійснюють жодного метаболізму і можуть витримати екстремальний фізико-хімічний тиск, наприклад, високі рівні ультрафіолетового випромінювання, гамма-випромінювання, детергентів, дезинфікуючих засобів, нагрівання, тиску і висушування. У такому неактивному стані ці організми у деяких випадках можуть залишатися життєздатними протягом мільйонів років та виживати навіть у космічному просторі. Ендоспори можуть бути причиною захворювань, наприклад, сибірська виразка може бути викликана вдиханням ендоспор Bacillus anthracis

Метан-окислюючі бактерії у роду Methylosinus також формують стійкі до висушування спори, так звані екзоспори, названі так тому, що вони формуються брунькуванням на кінці клітини. Екзоспори не містять діамінопіколінової кислоти, характерного компоненту ендоспор.

Іншими неактивними, оточеними товстою стінкою структури, які утворюються представниками родів Azotobacter, Bdellovibrio (бделоцисти), і Myxococcus (міксоспори) є цисти. Вони стійкі до висушування та інших шкідливих умов, але меншою мірою, ніж ендопори

При утворенні цист представниками Azotobacter поділ клітини завершується з утворенням товстої багатошарової стінки і оболонки, що оточує клітину.

Нитчасті Actinobacteria формують відтворюючі спори двох категорій: кондіціоспори, які є ланцюжками спор, сформованих з міцелієподібник ниток, та спорангієспори, які формуються в спеціалізованих мішечках, спорангіях.

Генетика Більшість бактерій мають одну кругову хромосому, розмір якої може бути від лише 580 000 пар нуклеотидів у патогена людини Mycoplasma genitalium до 12 200 000 пар основ в бактерії Sorangium cellulosum, що живе у ґрунті. Спірохети — відомий виняток, деякі з цих бактерій, наприклад, Borrelia burgdorferi, причина хвороби Лайма, містять єдину лінійну хромосому.

Бактерії також можуть містити плазміди, які є маленькими позахромосомними молекулами ДНК, що інколи містять гени стійкості до антибіотиків або фактори вірулентності.

Види плазмід 1. Трансмісивні (кон’югація). 2. Нетрансмісивні (трансдукція) 3. “Криптичні” - “приховані”, не містять генів. 4. Монокопійні — на 1 клітину припадає 1 плазмідна ДНК. 5. Мультикопійні — на 1 клітину — 10 - 20 плазмід.

Функції плазмід Види плазмід 1. Регуляторна (якщо ген не здатний реплікуватись за рахунок втрати його частини, плазміди вносять власний реплікон). 2. Кодуюча.

Види плазмід - Сol – продукція коліцинів - HLy – продукція гемолізинів - Tol – розщеплення толуолу, ксилолу - Ent – продукція ентеротоксину - Nif – зв’язування азоту в K. pneumoniae - Ti – утворення пухлин у рослин - Плазміди деградації: - Саm – розщеплення камфари - Oct - розщеплення октану - Sal - розщеплення саліцину

Критерії плазмідної Види плазмід локалізації генів - високий темп втрати ознаки - збільшення темпів втрати ознаки під впливом температури або хімічних сполук - спільна втрата або набуття декількох ознак

Інший вид бактеріальної ДНК — інтегровані віруси (бактеріофаги). Існують багато видів бактеріофагів, деякі просто заражають і руйнують бактерію-господаря, коли інші вставляють свою ДНК в бактеріальну хромосому. Бактеріофаг може містити гени, які змінюють фенотип господаря: наприклад, при еволюції Escherichia coli і Clostridium botulinum за допомогою бактеріофагу перетворили безневинних бактерій на смертельних патогенних.

Бактерії, як безстатеві організми, успадковують ідентичні копії генів своїх батьків (тобто, вони є клонами). Проте, всі бактерії можуть еволюціонувати шляхом змін їх генетичного матеріалу (ДНК) при мутаціях. Частоти мутацій сильно залежать від виду бактерії і навіть від штаму одного виду бактерій. Мутації у бактерій є наслідком як випадкових мутацій — помилок при зчитуванні протягом копіювання та впливу радіації — так і «стресових мутацій» , де бактерія навмисно збільшує частоту мутацій у стресових умовах.

Мутації Види плазмід 1. За походженням: спонтанні та індуковані 2. За локалізацією: нуклеоїдні та цитоплазматичні 3. За кількістю генів, що мутували: генні та хромосомні 4. За величиною: великі (хромосомні) і малі (точкові)

Мутації Види плазмід 1. Пряма мутація 2. Зворотна (обернена) мутація або реверсія 3. Супресорна мутація (внутрішньогенна, позагенна). Веде до відновлення фенотипу, а не генотипу. 4. Плейотропна мутація (зміна 2 -ох і більше властивостей клітини) 5. Нонсенс-мутація (робить кодон нісенітним – не кодує жодної амінокислоти)

Мутації Види плазмід 1. Хромосомні: - інверсія - дуплікація - делеція - дислокація

Мутації Види плазмід 1. Точкові: - делеція - інсерція (вставка) - заміна: - транзиція (пуринова основа на пуринову, піримідинова – на піримідинову) : А-Г, Т-Ц - трансверзія ( пуринова основа на піримідинову та навпаки)

Мутагенні фактори Фізичні: 1. УФО (λ-2600 А) – найсильніша мутагенна дія; утворюються димери тиміну, заміна основ 2. Іонізуюче опромінення (рентгенівське, гамма-промені)

Мутагенні фактори Хімічні: 1. Азотиста кислота (самий доступний і безпечний) 2. N-нітрозометилсечовина – супермутаген, канцероген 3. Етилметансульфонат 4. Акридини 5. Нітрозогуанідин 6. Аналоги основ (5 -бромурацил, 2 -амінопурин) 7. Лікарські препарати (нітрофурани, деякі антибіотики Біологічні: перекис водню

Деякі бактерії також можуть переносити генетичний матеріал між клітинами. Є три основні шляхи, як це може відбуватися. По- перше, бактерії можуть прийняти екзогенну ДНК із свого оточення у процесі, що називається трансформацією.

ДОСЛІД ГРІФФІТА

Частіше переносяться не хромосомні гени, а плазміди.

Гени можуть також бути перенесені за допомогою процесу трансдукції, коли бактеріофаг, вбудовуючись в бактерію привносить чужорідну ДНК до хромосоми.

Третій метод передачі гена — бактеріальна кон'югація, коли ДНК переноситься прямим контактом між клітинами, для чого можуть використовуватися деякі типи ворсинок.

Загалом всі ці шляхи переносу генетичнго матеріалу називаються горизонтальним переносом генів, і часто відбуваються за природних умов.

ЗНАЧЕННЯ Горизонтальний перенос генів грає у бактерій роль, дещо подібну до статевого розмноження у еукаріотів. Цей процес особливо важливий у придбанні бактеріями резистентності (стійкості) до антибіотиків, оскільки він дозволяє здійснювати швидку передачу генів резистентності між бактеріальними клітинами.

Транспозон і IS елемент

Функції IS-елементів 1. Координуюча: взаємодія транспозонів, плазмід, помірних фагів між собою та хромосомою бактерії, забезпечуючи їх реплікацію. 2. Регуляторна: викликають інактивацію генів, або служать промоторами (ділянки ДНК, які регулюють експресію клітинних генів). 3. Індукують мутації за типом делеції або інверсії

Функції транспозонів 1. Регуляторна. 2. Кодуюча. 3. Індукують генні мутації за типом делеції або інверсії. 4. Включення їх в реплікон супро-воджується абераціями (структурними перебудовами) в ДНК цих репліконів; найчастіше проявляються інсерції, делеції, інверсії

Функції транспозонів 1. Регуляторна. 2. Кодуюча. 3. Індукують генні мутації за типом делеції або інверсії. 4. Включення їх в реплікон супро-воджується абераціями (структурними перебудовами) в ДНК цих репліконів; найчастіше проявляються інсерції, делеції, інверсії

R і S форми колоній

Властивості мікробів S-колоній Клітини нормальної морфології Дифузне помутніння бульйону У рухомих видів є джгутики У капсульних варіантів є капсули Біохімічно більш активні Повноцінні в антигенному відношенні У патогенних видів – вірулентні Виділяються в гострому періоді хвороби Чутливі до бактеріофагів Менш чутливі до фагоцитозу

Методи виявлення мутантів За різницею в швидкості росту (посів на мінімальне середовище; Мутанти виростають) Різна здатність до виживання Метод реплік Ледерберг

Метод реплік для виявлення ауксотрофних мутантів

SOS-реактивація При множинних ушкодженнях ділянки з мутаціями переводяться в неактивний стан, а їх роль виконує неушкоджена ділянка ДНК

ТРАНСДУКЦІЯ Викликають помірні, дефектні фаги Види: - загальна (генералізована) - специфічна - абортивна

ВІДМІННОСІ ТРАНСДУКЦІЇ ТА ФАГОВОЇ КОНВЕРСІЇ Трансдукція – перенос генетичної інформації з клітини в клітину за допомогою фага Фагова конверсія - експрeсія в клітині генів бактеріофагу (Corynebacterium diphtheriae, Clostridium botulinum, Staphylococcus spp. , Salmonella spp. )

Деякі гормони людини, які продукуються рекомбінантними мікроорганізмами Білок Назва речовини Інсулін Гумулін, Новолін Соматостатин Протропін, Гуматроп Інтерферон альфа Роферон, Велферон Інтерферон гамма Актимун Інтерферон бета Фрон, Бетасерон Інтерлейкін-2 Пролейкін Фактор некрозу пухлин - Еритропоетин Прокріт, Епоген Гранулоцит колоніє- Філграстин, Ньюпоген стимулюючий фактор

ГЕНЕТИКА ВІРУСІВ Способи збільшення інформації: - дворазове зчитування одієї іРНК з інших ініціюючих кодонів - зсув рамки трансляції - сплайсинг (вирізання інтронів) - транскрипція з ділянок ДНК, що перекриваються

У вірусів можуть бути: Модифікації (зміна складу білків капсиду, суперкапсиду під впливом клітин) Мутації (розмір бляшок під агаровим покриттям, нейровірулентність для тварин, чутливість до дії хіміотерапевтичних агентів, ts-мутації – температурочутливі – вірус втрачає здатність розмножуватись при підвищених температурах Рекомбінації

ВИДИ НЕГЕНЕТИЧНОЇ ВЗАЄМОДІЇ ВІРУСІВ 1. Фенотипове змішування 2. Негенетична реактивація 3. Комплементація 4. Стимуляція 5. Інтерференція