Генетика мицелиальных аскомицетов Aspergillus 1 2

Генетика мицелиальных аскомицетов Aspergillus 1

2

3

4

Aspergillus niger • • Виды группы A. Niger вырабатывают разнообразные ферменты — амилолитические, протеиназы, пектиназу, липазу, глюкозооксидазу, ферменты, разрушающие роговое вещество, хитин и др. используется для производства ряда красок, чернил, некоторых фармацевтических препаратов. В настоящее время при помощи пектолитических ферментов A. niger и A. foelidus в ряде стран производят осветление фруктовых соков и вин. Из инулина под действием фермента A. niger можно получать фруктозу, и т. д. A. niger - в производстве лимонной, щавелевой, глюконовой, фумаровой кислот. Штаммы группы A. niger способны синтезировать витамины биотин, тиамин, рибофлавин и др В ряде тропических стран отмечены заболевания растений, вызываемые штаммами A. niger, например проростков арахиса, хлопчатника, сорго в Восточной Африке (Судан), Индии. Штаммы A. niger, выделенные из заплесневелых кормов, оказались токсичными для животных. 5

Aspergillus flavus-oryzae • Конидиеносцы у некоторых видов несут на вздутии только фиалиды. • Эти грибы встречаются в почве и на самых разнообразных субстратах: растительных остатках, фураже, пищевых продуктах, растительных маслах, пластических массах, на воске, парафине. Грибы этой группы — главные компоненты сообщества плесневых грибов, развивающихся на зерне и семенах, главным образом на рисе, горохе, соевых бобах, арахисе, в плохо проветриваемых хранилищах, даже при 18% влажности. Выделяет афлатоксин – причина заболевания птиц и животных 6

Aspergillus fumigatus • антибиотик фумагиллин, активный против стафилококкового бактериофага и амебной дизентерии, нозематоза пчел, активно тормозящий развитие ряда опухолей. • алкалоид фестуклавин, используемый в медицине и ранее получаемый только из спорыньи (Claviceps purpurea), и два новых алкалоида — фумигаклавины А и В. • A. fumigatus приписывают активную роль в разрушении хитиновых веществ в почве. 7

Aspergillus versicolor 8

Aspergillus nidulans • A. nidulans и полученные из диких штаммов мутанты используют для изучения углеводного, азотного и других типов обмена. 9

Aspergillus nidulans - особенности генетического анализа • Гвидо Понтекорво – основоположник генетики аспергилла • Жизненный цикл Aspergillus nidulans • Парасексуальный цикл – как инструмент генетического анализа мицелиальных грибов • Использование гаплоидизации для определения групп сцепления • Митотический кроссинговер • Этапы картирования генов у Аспергилла 10

Aspergillus nidulans Guido Pontecorvo (1907 -1999) Parasexual cycle genetics 11

The Pontecorvo Brothers Guido Bruno Gillo 12

13

Цикл развития и аски Aspergillus nidulans 14

конидии аспергилла всегда одноядерные. 15

Мутанты у Aspergillus nidulans 16

• Парасексуальный цикл : • слияние генетически различных гаплоидных ядер в гетерокарионе • митотический кроссинговер • гаплоидизация 17

• Гетерокарион формируется из двух генетически различных ядер и нестабилен, но может поддерживаться при пермиссивных условиях. • Два гаплоидных ядра могут сливаться, образуя гетерозиготный диплоид, который может формировать мицелий и расти вегетативно, оставаясь стабильным. • Митотический кроссинговер происходит между гомологичными хромосомами. • Нерасхождение хромосом (гаплоидный набор аспергилла- 8 хромосом) приводит к их спонтанным потерям, и постепенно, теряются все, после чего восстанавливается гаплоидный набор хромосом. • Great lab tool, but importance in nature is unknown 18

The parasexual cycle (genetic recombination without meiosis). Stages of the parasexual cycle are numbered as follows (1) Hyphal conjugation (plasmogamy). (2) Heterokaryosis. (3) Nuclear fusion (karyogamy). (4) Mitotic recombination and nondisjunction. (5) Haploidization and nuclear segregation 19

20

21

22

Гетерокарион [w +] + [+y] продуцирует конидии желтого и белого цвета на фоне темно-зеленых гетерокарионов 23

24

A. nidulans: конидии одноядерные, штаммы имеют желтые и зеленые конидии и могут синтезировать биотин или тиамин Эксперимент: green bio+ thi- x yellow, biotin-, thi+ Смешиваем оба штамма и получаем: Зеленые конидии и желтые конидии на одной головке, могут расти на минимальной среде , следовательно синтезируют биотин и тиамин 2. Желто-зеленые конидии , по размеру превосходящие гаплоидные конидии, прототрофны 3. Продолжаем выращивать желто-зеленые, более крупные, получаем следующие комбинации желтые, биотин-, тиамин+ Зеленые, биотин +, тиамин. Желтые , биотин +, тиамин. Зеленые, биотин -, тиамин+ • • 1. 25

Haploidization is common 1 in 103 diploid nuclei 26

Гаплоидизация • Гаплоидизация происходит спонтанно • Гены, локализованные в разных хромосомах ведут себя независимо • Гены одной хромосомы обнаруживают абсолютное сцепление • Для локализации неизвестного маркера в хромосоме необходимо установить, с какими из маркеров постоянно ассоциирован исследуемый ген 27

Установление группы сцепления, в которой находится мутация • Родительские штаммы: множественно маркированный тестерный штамм и штамм с картируемой мутацией • Анализируют гетерозиготный диплоид • Удобнее использовать штаммы, у которых хромосомы маркированы сразу двумя мутациями 28

Локализация маркера в группе сцепления с помощью гаплоидизации • su ad w_____ pu ad phen X • + ad + + • • su - рецессивный супрессор ad аd - ауксотрофность по аденину w - белый цвет колонии + - зеленый цвет колонии • • Диплоид имеет зеленые колонии и не растет на среде без аденина Для того, чтобы отобрать колонии, в которых произошла гаплоидизация отбирают белые колонии – следствие потери хромосомы, не растущие на среде без аденина – следствие потери хромосомы с супрессором Частоту потерь повышают беномилом • 29

Задача • • • Aspergillus nidulans Генотип первого родительского штамма Y pu ad sen + phen + + b + Диплоид Y – желтые колонии Pu – потребность в путресеине Ad- потребность в аденине Sen B – потребность в биотине Phen – потребность в фенилаланине 30

Гаплоидные сегреганты y pu ad + + + 11 + pu ad + + b 1 y + phen + 26 y + Всего ad sen Число штаммов + + sen + phen + + 7 52 сегреганта 31

Обсуждение • Y pu – находятся на разных хромосомах, так как признаки рекомбинируют • pu ad – на одной хромосоме, так как между локусами нет рекомбинации • ad sen – на разных хромосомах • Sen phen – на одной хромосоме • Phen B – на разных • y b – на одной • ________________________ • Следовательно на 1 хромосоме – y b • На 2 хромосоме – pu ad • На 3 – sen phen 32

Митотический кроссинговер позволяет локализовать гены в пределах группы сцепления • Кроссинговер на участке ген-центромера приводит к гомозиготизации всех генов, расположенных дистальнее точки обмена в половине ядер – потомков рекомбинантного ядра • Расстояние наиболее удаленного от центромеры маркера принимаентся за 100%, а расположение других определяется по формуле • • D=Nab / Nb x 100% D – расстояние от гена до центромера Nb – общее число митотических сегрегантов, гомозиготных по b Nab – число сегрегантов, гомозиготных по а и b одновременно 33

a. Allele designations are as follows: i. w (with either y or y+) produces white colonies, w+y produces yellow, and w+y+ produces green. ii. ad cells require adenine in the growth medium, ad+ do not. iii. pro cells require proline in the growth medium, pro+ do not. iv. paba cells require para-aminobenzoic acid (PABA) in the growth medium, paba+ do not. v. bi cells require biotin in the growth medium, bi+ do not. 34

Photo of a green diploid Aspergillus colony, genotype w ad+ pro paba+ y+ bi/w+ ad pro+ paba y bi+ with a yellow and white sector. 35

Possible mitotic crossing-over event between the pro and paba loci that can give rise to a diploid yellow sector in the green diploid Aspergillus strain 36

Production of diploid yellow sector in a green diploid Aspergillus strain by mitotic crossing-over between the paba and y loci. 37

Митотический кроссинговер • Происходит рекомбинация маркеров одной группы сцепления • Происходит на стадии 4 -х нитей • Обмениваются 2 несестринские нити • В результате обмена образуются реципрокные продукты 38

Картирование 1. С помощью гаплоидизации устанавливают группу сцепления 2. Порядок расположения маркеров определяют с помощью митотического кроссинговера 3. Принадлежность разных плеч к одной хромосоме с помощью 1 и 2. 39

Заключение • У аспергилла доступен и анализ при половом расщеплении • Расположение генов при мейотическом и митотическом картировании совпадает • Генетический анализ сегрегации в митозе значительно облегчает локализацию генов 40