Генетика бактерий Экспрессия генетической информации у бактерий Доцент

Генетика бактерий. Экспрессия генетической информации у бактерий Доцент кафедры микробиологии и вирусологии Сиб. ГМУ О. С Жданова

Геном бактерий n n Геном – совокупность всех генов бактерий; Бактерии – гаплоидные организмы, имеют один набор генов; Размер определяется количеством нуклеотидных пар оснований (н. п. о. ); Размер генома E. coli - 3, 8 • 106 н. п. о.

Организация генетического аппарата бактерий n n n Нуклеоид - одна двунитевая молекула ДНК кольцевой формы; Содержание ДНК непостоянно, может соответствовать 2, 4, 6, 8 хромосомам; Внехромосомные генетические элементы – плазмиды, транспозоны, вставочные последовательности, умеренные бактериофаги.

Нуклеоид содержит информацию необходимую для обеспечения основных процессов жизнедеятельности - кодирует синтез ферментов, участвующих в пластическом и энергетическом метаболизме.

Организация нуклеоида n n кольцевая молекула ДНК; длина 1, 6 мм, диаметр 1 мкм; суперскрученное состояние обеспечивается топоизомеразой; петли образуют домены, удерживаются РНК (т. РНК, и. РНК);

Общая характеристика генома бактерий n n n структурные гены – кодирующие области – 85% последовательностей ДНК бактерий; регуляторные области; некодирующие последовательности – 10% генома – мигрирующие элементы, сайты рекомбинации, регуляторы транскрипции.

Оперонная организация бактериальных генов n n n Франсуа Жакоб n n Оперон – группа структурных генов (кодируют признаки), находящихся под общим контролем; В состав оперона входит промотор и оператор; Промотор – участок ДНК, с которым связывается РНКполимераза; Оператор – участок ДНК, с которым связывается регуляторный белок; Терминатор транскрипции. Жак Люсьен Моно

Внехромосомные генетические элементы - плазмиды, транспозоны, вставочные последовательности n Различаются по молекулярной массе, объему закодированной информации, способности к самостоятельной репликации; n Выполняют кодирующие и (или) регуляторные функции; n Кодируют дополнительную генетическую информацию, обеспечивающую бактериальным клеткам селективные преимущества.

Плазмиды автономно реплицирующиеся двухцепочечные молекулы ДНК

Классификация плазмид по свойствам n n n F – плазмиды; R – плазмиды; Col – плазмиды; Ent – плазмиды; Hly – плазмиды; Биодеградативные плазмиды;

Классификация плазмид по способу межклеточной передачи n Конъюгативные (трансмиссивные) – осуществляют собственный перенос путем конъюгации. Содержат tra-опероны – гены ответственные за перенос; n Неконъюгативные (мобилизуемые) – передаются путем трансдукции, трансформации или с помощью конъюгативных плзмид.

Классификация плазмид по совместимости n n n Несовместимость – родственные плазмиды, обладающие высоким сходством репликонов неспособны существовать в одной клетке; Несовместимые друг с другом, но совместимые с другими собраны в inc-группы (англ. Incompatibility - несовместимые); Плазмиды одной inc-группы обладают общими признаками: молекулярная масса, высокая степень гомологии, синтез морфологически сходных и серологически родственных донорных ворсинок.

Значение плазмид n n обусловливают гетерогенность микробных популяций; контролируют обмен генетическим материалом; контролируют синтез факторов (в том числе патогенности), обеспечивающих сохранение видов бактерий в природе; биологическое средство самозащиты бактерий (приобретение и наследование устойчивости к лекарственным препаратам).

Транспозоны (Tn)- мобильные генетические элементы прямые повторы n n Фрагменты ДНК, состоящие из генов, кодирующих транспозицию (перемещение) и признаки; Способны мигрировать по хромосоме, из хромосомы в плазмиды, ДНК умеренных фагов; Реплицируются только в составе хромосомы; Выполняют регуляторную и кодирующую функции.

Вставочные последовательности (ISэлементы) транспозаза ИНВЕРТИРОВАННЫЕ ПОВТОРЫ n n n Фрагменты ДНК, несущие только гены, кодирующие собственное перемещение (транспозицию) - фермент транспозазу и репрессор; Гены по флангам окружены инвертированными повторами; Способны перемещаться только по хромосоме.

Функции IS-элементов n n n Координируют взаимодействие мобильных генетических элементов между собой и бактериальной хромосомой; Регулируют экспрессию структурных генов; Индуцируют мутации.

«Островки» патогенности – фрагменты ДНК, кодирующие факторы болезнетворности n n n Обнаружены в геноме болезнетворных бактерий; Располагаются отдельными кластерами в хромосомах, плазмидах и умеренных фагах; Связаны между собой топографически и функционально; Отличаются высокой степенью чужеродности по процентному содержанию нуклеотидов гуанина и цитозина (G+C); Отличаются нестабильностью.

Структура «островков» патогенности n n n Содержат мобильные элементы (IS), гены подвижности (интегразу, транспозазу), гены вирулентности (V 1 -V 4); По обоим концам имеются прямые повторы (DR) (распознаются ферментами и вырезаются); Располагаются вблизи генов т. РНК.

Передача генетической информации у бактерий n по вертикали (по наследству) – обеспечивает передачу всех генов исходной особи и стабильность генома;

Передача генетической информации у бактерий n по горизонтали – способствует возникновению новых признаков – изменчивости; n основной механизм видообразования у бактерий (реализуется посредством процессов конъюгации, трансдукции, трансформации).

Конъюгация - перенос генетического материала посредством конъюгативных пилей определяется наличием Fплазмиды (содержит traоперон); n tra-оперон кодирует гены переноса, синтез половых пилей, ферментов хеликазы и эндонуклеазы; хеликаза осуществляет разрывы водородных связей в двухцепочечной ДНК; эндонуклеаза узнает участок ori. T и осуществляет однонитевой разрыв ДНК, начинается репликация; F-плазмида может быть трансмиссивной и интегративной. n n

Трансмиссивная F-плазмида n n n передача плазмиды осуществляется в течении нескольких минут, в результате реципиент приобретает донорские свойства n находится в клетке в автономном состоянии; при участии хеликазы и эндонуклеазы образуется однонитевая ДНК; нить ДНК переносится в реципиентную клетку по принципу катящегося кольца; в обеих клетках по матрице одной нити ДНК комплементарно восстанавливается двунитевая структура.

Интегративная F-плазмида n n n процесс длится около 90 мин, рекомбинант донорские свойства, как правило, не приобретает n n F-плазмида и хромосома бактериальной клетки вместе образуют единый трансмиссивный репликон; клетки со встроенной F-плазмидой называют Hfr-доноры (англ. high frequency of recombination), т. к. они с высокой частотой переносят свои гены бесплазмидным клеткам; ДНК расщепляется в месте интеграции F-плазмиды, одна нить передается реципиенту; сначала передается часть плазмидной ДНК от ori. T, затем хромосомная ДНК; хрупкость конъюгативного мостика приводит к спонтанным разрывам, переносится только фрагмент хромосомной ДНК.

Трансформация – поглощение бактерией-реципиентом фрагментов ДНК бактерии-донора из внешней среды (Гриффит 1928, Эйвери 1944) n n n поглощение фрагментов ДНК и включение в хромосому бактерии реципиента; ДНК должна быть двунитевой; длина фрагмента должна составлять 1 -2% длины хромосомы; реципиенты должны быть компетентными (конец лог-фазы); фактор компетентности связывается с рецепторами КС → синтез аутолизина, ДНК-связывающего белка, эндонуклеазы I.

Механизм трансформации n n n Аутолизин разрушает КС, обнажает ДНКсвязывающий белок и эндонуклеазу I; ДНК-связывающий белок абсорбирует фрагменты донорной ДНК (22 -45 тпо); эндонуклеаза. I на определенном расстоянии на фрагментах ДНК (6 тпо) делает одноцепочечные разрывы; одна цепь ДНК деградирует; фрагменты ДНК проникают в клетку и связываются с белком, защищающим их от деградации; интеграция в хромосому реципиента.

Трансдукция передача генетического материала от одной бактерии 1. Инфицирование бактерии фагом другой посредством бактериофага n n n абортивная – принесенный фагом фрагмент ДНК бактерии не 2. Фрагментация ДНК бактерии при индукции фага включается в хромосому реципиента; специфическая - фаговая ДНК интегрирует в хромосому общая (неспецифическая) - перенос бактериофагом любого 3. Включение в оболочку фага фрагментов бактерии с образованием профага. При исключении ДНК фага гена бактериальной хромосомы. бактериальной ДНК Осуществляется из бактериальной хромосомы захватывается прилегающий к плазмидоподобными фагами РI или умеренными месту включения фаговой ДНК фрагмент бактериальной неспецифическими фагами (Mu), способными встраиваться в 4. Инфицирование трансдуцирующим фагом хромосомы. любое место бактериальной хромосомы; реципиентной бактерии, обмен гомологичными участками ДНК 5. Рекомбинантная бактерия

Экспрессия генетической информации у бактерий

Бактерии – универсальные существа n Отдельная бактериальная клетка – полноценный самодостаточный организм; n Клетки многоклеточных входят в состав специализированных тканей и выполняют строго определенные функции.

Парадокс бактериальной клетки Высокая метаболическая активность (правило Рубнера); n Высокая ферментативная насыщенность (до 109 -1012 nреакций в минуту); Размер бактерий в среднем составляет 0, 5— 5 мкм; n n. Бактерии способны использовать в Геном бактерий представлен 4 100 генов. качестве энергетических субстратов и источников пластического материала разнообразные вещества; n Пластичность метаболизма обеспечивает высокую выживаемость и приспособляемость; n В первую очередь утилизации подвергаются легко усвояемые субстраты. n

Быстрая адаптация к изменяющимся условиям среды - необходимое условие выживания n n Бактерии должны иметь все ферменты, необходимые в разных условиях существования; Информация о синтезе ферментов закодирована в геноме; Ферменты: конститутивные, индуцируемые, репрессируемые; Механизмы «включения» и «выключения» генов обеспечивает экономный расход энергии и пластического материала.

Бактерии нуждаются в получении информации о своем окружении Способы получения информации бактериями: n n n непосредственный контакт при конъюгации с другими бактериями; дистантное взаимодействие (носителями информации являются УФ, электромагнитные волны светового и инфракрасного диапазонов); физико-химические сигналы.

Внешние сигналы определяют экспрессию генов n Сигналы распознаются и преобразуются; n Передаются генетическим структурам; n Эта информация реализуется на уровне генов, путем их экспрессии или инактивации.

Регуляторы экспрессии генетической информации n двухкомпонентные сигнальные системы. Широко распространенны среди прокариотических организмов. Сенсорная киназа– ключевой компонент системы; n σ-фактор участвует в формировании РНК-полимеразы и распознает промотор на ДНК, с которого начинается процесс транскрипции; n белки глобальные регуляторы выполняют роль общего регулятора экспрессии генов (белок активатор катаболитных оперонов – БАК). Контролируют экспрессию многочисленных разрозненных генов и оперонов.

Уровни регуляции метаболизма n n На уровне транскрипции (путь от ДНК к РНК); Регуляция на начальных этапах экспрессии самый эффективный способ экономии ресурсов (посредством промоторов, регуляторных белков, белков глобальной регуляции); Наиболее часто используется бактериальной клеткой; На уровне трансляции (от РНК к белку).

Регуляторы экспрессии оперонов Эффекторы Регуляторные белки не способны связываться с ДНК (субстраты, продукты конечного синтеза, ц. АМФ) Продукты генов-регуляторов n n n Индукторы (опероны индуцибельные); Корепрессоры (опероны репрессибельные) n Связываются с участком ДНК -оператором; Осуществляют позитивный или негативный контроль

Эффекты связывания регуляторного белка с оператором n Негативный контроль регуляторный белок препятствует транскрипции Фермент не синтезируется n Позитивный контроль регуляторный белок обеспечивает транскрипцию структурных генов Синтез фермента

Индуцибельные опероны n n n Катаболитные опероны; Цель регуляции – включить синтез ферментов, которые ранее не требовались; Оперон «включается» в присутствии молекул индуктора; Лактозный оперон - пример оперона, работа которого находится под негативным контролем; Арабинозный оперон – находится под позитивным контролем регуляции.

Катаболитная репрессия n n n Если в среде присутствует несколько субстратов (глюкоза и лактоза), то сначала утилизируется субстрат, поддерживающий наиболее высокую скорость роста - глюкоза; Период генерации на среде с глюкозой 50 мин, с лактозой 80 мин; При этом сначала синтезируются ферменты для утилизации глюкозы, а поступление лактозы в клетку подавляется; После утилизации глюкозы, используется лактоза; Смена синтеза ферментов для утилизации разных субстратов сопровождается сменой фаз роста в культуре - диауксия.

Механизм катаболитной репрессии n n n Эффектором выступает ц. АМФ; Белок активатор катаболитных оперонов (БАК) неактивен в свободном состоянии; Комплекс БАК-ц. АМФ имеет сродство к промотору; Обеспечивает связь промотора с РНКполимеразой и усиливает транскрипцию в 20 -50 раз; Количество комплексов БАК-ц. АМФ зависит от количества ц. АМФ.

Циклический АМФ регулятор активности БАК n n Образуется из АТФ с помощью аденилатциклазы; При недостатке глюкозы компоненты ее транспорта в клетку приводятся в активное состояние – фосфорилируются; фосфорилирование обеспечивается аденилатциклазой и сопровождается увеличением ц. АМФ; Увеличение ц. АМФ → увеличение комплексов БАКц. АМФ → увеличение связи РНК-полимеразы с промотором → увеличение транскрипции.

Арабинозный оперон n n n Гены ara. А, ara. В, ara. D структурные – кодируют синтез ферментов, образуют оперон ara. ВАD ; Ген ara. С кодирует регуляторный аллостерический белок Ara. C, имеющий центр связывания с арабинозой; Связываясь с арабинозой регуляторный белок становится активатором ara. ВАD-оперона; В отсутствие арабинозы Ara. C связывается с участками ДНК и образует петлю, препятствуя транскрипции; Ara. C осуществляет негативную и позитивную регуляцию.

Структура арабинозного оперона Регуляторная область Структурные гены D n n n A B I O P Ген регулятор C В присутствии арабинозы Ara. C превращается в активатор, присоединяется к инициатору (I); БАК в комплексе с ц. АМФ связывается с ДНК в области промотора; К промотору присоединяется РНК-полимераза.

Работа арабинозного оперона в присутствии арабинозы БАК ц. АМФ D A B I O C Репрессор n оза бин n ара Актива тор Белок активатор катаболитных оперонов (БАК) активируется в комплексе ц. АМФ; Усиливает транскрипцию.

Работа арабинозного оперона в отсутствии арабинозы D A B I O C Репрессор

Репрессибельные опероны n n n Характерны для анаболических путей. Цель регуляции – прекращение синтеза; Оперон «выключается» в присутствии молекул корепрессора; Ген регулятор кодирует апорепрессор – репрессор в неактивной форме; Апорепрессор имеет два активных центра, один для связывания с метаболитом (корепрессором), второй – для связывания с геном оператором; Триптофановый оперон (регуляция негативная, аттенуация - регуляция транскрипции на уровне трансляции).

Триптофановый оперон n n При наличии в среде триптофана, его синтез прекращается (репрессия конечным продуктом); Эффектор (корепрессор) – триптофан – связывается с апорепрессором и активирует его; Репрессор связывается с оператором, блокируя синтез триптофана; В отсутствии корепрессора апорепрессор не имеет сродства к оператору, идет синтез аминокислоты.

Принцип работы триптофанового оперона Наличие триптофана в среде Сродство репрессора к оператору Синтез триптофана нет да да да нет

Аттенуация – механизм тонкой регуляции экспрессии структурных генов n n n Позволяет регулировать количество синтезирующегося триптофана; При избытке триптофана – транскрипция генов оперона большинством молекул РНК-полимеразы прерывается; При недостатке триптофана транскрипция генов оперона увеличивается.

Аттенуатор - последовательность нуклеотидов в регуляторной области перед первым структурным геном Регуляторная область Регуляторный ген n n n Р О А Р - промотор; О - оператор; А – аттенуатор. n Структурные гены Управляет активностью РНК-полимеразы.

Заключение n n n n Геном бактерий представлен хромосомой и внехромосомными факторами; Рекомбинация бактерий обеспечивается конъюгацией, транформацией и трансдукцией; Структурные гены бактерий организованы в опероны; Работой оперонов управляют эффекторы и регуляторные белки; Эффекторы «включают» или «выключают» гены, связываясь с регуляторными белками; Регуляторные белки осуществляют позитивный или негативный контроль; Различают индуцибельные (катаболитные) и репрессибельные (анаболитные) опероны.