Генетическая модификация геномов эукариот 1. Направленное изменение структуры

Генетическая модификация геномов эукариот 1. Направленное изменение структуры генов и хромосом генома-мишени 2. Введение (перенос) чужеродных генов от одного животного в геном другого вида 3. Создание генно-инженерных конструкций и введение их в геном животных Синонимы: генетическая трансформация –чаще применяется для прокариот Перенос генов или трансгенез – используется для геномов животных или эукариотических клеток

Важные даты открытия генетической трансформация Трансформация пневмококков Griffith Frederick 1928 Трансформация б/к материалом Dawson and Sia 1931 Alloway 1932 Avery Oswald 1934 -1941 Очистка трансформирующего фактора Первое сообщение о роли ДНК в трансформации Avery, Mc. Carty, Mac. Leod 1944 Первое сообщение о трансформации эукариотических клеток с помощью метафазных хромосом суммарной ДНК Трансгенные мыши Mc. Bride, Ozer 1973 Wigler et al. 1978 Gordon et al. 1980 Wagner et al. 1981

Схема развития одно-клеточного эмбриона мыши Хроматин мужского и женского пронуклеусов представлены темным и серым цветами. PN 1 – небольшие пронуклеусы расположены по периферии эмбриона; PN 2 – пронуклеусы увеличиваются в размерах и начинают двигаться к центру эмбриона; PN 3 – большие пронуклеусы двигаются к центру; PN 4 большие пронуклеусы находятся рядом в центре эмбриона; PN 5 – пронуклеусы сливаются.

Микроинъекция ДНК в пронуклеус зиготы мыши

G -CSF

Конструкция с геном-репортером «зеленый белок» (GFP) под контролем промотора бета-актинового гена курицы и селектируемым геном устойчивости к пуромицину

Экспрессия репортерного гена у гетерозиготных по трансгену у двух (b) из 3 -х бластоцист (a), у эмбриона 10 -го дня развития (c). Распределение «зеленого белка» в структурах головы эмбриона. Срез головы эмбриона на криотоме.

Визуализация меченых «зеленым белком» клеток в химерных эмбрионах (a, b), в смешанных культурах нейральных клеток трансгенных и нетрансгенных животных (с, d) и в головном мозге химер (e-g).

G -CSF

Вектор p. CG 3, ген G-CSF человека под контролем промотора гена αS 1 -казеина козы 5’ 3409 пн 1504 пн 1518 пн ATG 5`- фланкирующая последовательность гена αS 1 -казеина козы 3`- фланкирующая UTR последовательность гена αS 1 -казеина коровы - экзоны 1, 18 и 19 гена αS 1 - казеина - интроны 1 и 18 гена αS 1 - казеина - полноразмерный ген G-CSF человека 3’

Идентификация трансгенных коз с помощью ПЦР 705 bp 531 bp 200 100 АВ-праймер 200 100 СD -праймер • 58, 60, 78, 83 – трансгенные потомки • 57, 59, 79, 80 – нетрансгенные животные • k+ – позитивный контроль (ДНК трансгена) • k- –негативный контроль (без полимеразы) • L 100 – маркер с шагом 100 пн

Экспрессия трансгена в молочной железе у лактирующих трансгенных самок мышей • 58, 60, 78, 83 – трансгенные самки • K – контроль (РНК тетрансгенных лактирующих самок)) • K – негативный контроль (без РНК) • L 100 – маркер с шагом 100 пн

Мозаичный тип наследование трансгена p. CGm 1 в потомстве основателя, трансгенного самца #35. Красный цвет и зеленый цвета обозначают трансгенных и нетрансгенных потомков

Менделевское наследование трансгена p. CGm 1 в потомстве основателя, трансгенного самца #38. Красный цвет и зеленый цвета обозначают трансгенных и нетрансгенных потомков, соответственно.

Результаты Вестерн-блот анализа молока трансгеных мышей с конструкцией p. CGm 1 и p. CGm 2 1 - маркеры с различныим молекулярными весами, в к. Д; 2 - молоко нетрансгеной самки; 2 -препарат рекомбинантного Г-КСФ человека (негликозилированный -20 к. Д); 4, 6 и 8 - самки с трансгеном p. CGm 2, а 5, 7 и 9 с трансгеном p. CGm 1. Гликозилированная форма Г-КСФ 22 к. Д.

Номера потомков в линии основателя № 35 Поколение Дни лактации 368 F 1 12 67, 7 358 F 1 7 405 372 F 1 12 67 36* F 2 14 900 38* F 2 14 420 012 F 2 10 380 40 F 2 17 1000 93 F 3 7 141 Количество Г-КСФ человека в молоке трансгенных самок (мкг/мл)

Carlos – первая трансгенная коза в Латинской Америке

Первая трансгенная коза Конструкция, содержащая ген G-CSF человека под контролем промотора гена alfa S 1 казеина козы Праймеры: K- 3 4 5 6 7 8 с. D 9 Праймеры: АВ 10 11 12 L K- 3 4 5 6 700 пн 530 пн 15 13 14 15 16 K+ L 7 8 9 10 11 12 13 14 L

Первые стадии развития эмбриона 2 клетки 4 клетки 8 клетки морула бластоциста