ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК Векторы для животных

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК

Векторы для животных клеток Наиболее распространены векторы на основе следующих вирусов животных: 1. SV 40 – паповавирус, геном представлен ДНК размером 5243 п. о. Природные хозяева – макаки-резусы клетки-хозяева при культивировании – почки африканских зеленых мартышек (клеточные линии: Vero, CV-1). 2. Вирус полиомы – ДНК, 5295 п. о. клетки-хозяева – мыши, крысы получение интерферона человека 3. ВPV-1 вирус папилломы (бородавки) быка – «голый» вирус, 7945 п. о. внехромосомный вектор, т. е. не встраивается в хромосомы получение интерферона человека 4. Аденовирусы – «голый» вирус (без капсида) почти весь геном может быть замещен структурным геном клетки-хозяева: человек и др. позвоночные 5. HSV-вирус герпеса (есть капсид) клетки-хозяева: человек и др. позвоночные

Векторы для животных клеток (продолжение) 6. Ретровирусы – обеспечивают стабильную интеграцию гена в геном животной клетки 7. Бакуловирусы – вирусы насекомых; не опасны для животных NPV – вирус калифорнийской совки - имеет очень сильный промотор - в цитоплазме накапливается до 25% суммарного белка 8. Транспозоны эукариот

Краткая характеристика вируса SV 40 – сферический вирус, содержащий 2 -х цепочечную кольцевую ДНК, в которой установлены участки, кодирующие пять вирусных белков: - малый Т-антиген - большой Т-антиген - VP 1 – главный белок капсида - VP 2 и VP 3 белки представлены в меньших количествах При попадании в клетку SV 40 направляется к ядру. Первыми транскрибируются гены малого и большого Т-антигенов. Новые вирусные частицы появляются приблизительно через 30 ч, через 4 суток все клетки разрушаются. Тот же инфекционный процесс может быть инициирован в результате трансфекции с помощью очищенной ДНК вируса.

Векторы на основе SV 40 Различают 3 типа векторов 1. Трансдуцирующие SV 40 -векторы - реплицируются - упаковываются в вирионы 2. Плазмидные SV 40 -векторы - реплицируются 3. Пассивные трансформирующие SV 40 -векторы - необходимо присутствие вирусов-помощников, синтезирующих продукты недостающих генов

Трансформация животных клеток 1. Кальций-фосфатный метод ДНК образует комплекс с микрокристаллами фосфата кальция, кот. проникают в клетку за счет фагоцитоза 2. Использование ДЕАЕ-декстрана Дает комплекс с ДНК, что предохраняет ее от действия клеточных рестриктаз 3. Физические методы - электропорация 5 -10 кв/см; 2 -4 тыс. вольт 70 -80 трансформантов на 1 млн. клеток (1 мг ДНК)

Трансформация животных клеток (окончание) - метод микроинъекций - с помощью иглы: трансформируется 25% клеток, по наследству признак передается у 2% трансформантов - с помощью микропипетки (0. 1 -0. 5 микрона): трансформируется 50% клеток; выживаемость меньше Преимущества: - в принципе любую ДНК можно ввести в любые клетки - не требуется никакого селективного давления для сохранения в клетке введенного гена Недостатки: - дорогостоящее оборудование - длительная практика для овладения методом 4. Липосомы – задействуется механизм эндоцитоза 5. Слияние сферопластов с клетками в присутствии ПЭГ путем прямого переноса плазмид (челночных) из бактерий в клетки 6. Вирусный метод – действие вирусов и вирусоподобных частиц (используют оболочки вируса Сендай, полиомы)

Физические методы При использовании физических методов для доставки генов требуется сложное и дорогое оборудование, дают низкую эффективность трансфекции и имеют ограниченную область применения, но в некоторых случаях незаменимы.

Фенотипический отбор трансформированных клеток (селекция) Существуют 2 основных подхода: 1. Применение мутантных клеток-хозяев (tk-)

Фенотипический отбор на селективной среде НАТ в случае мутантных клеток-хозяев

Фенотипический отбор трансформированных клеток 2. Применение нормальных клеток-хозяев. Пример 1. Доминантный ген E. coli gpt

Фенотипический отбор на селективной среде в случае нормальных клеток-хозяев

Фенотипический отбор на селективной среде в случае нормальных клеток-хозяев Пример 2. Доминантный ген E. coli neo • Ген E. coli neo кодирует аминогликозидфосфотрансферазу • Отбор трансформантов проводится на селективной среде, содержащей антибиотик G-418 (аналог неомицина и канамицина). На этой среде выживают только рекомбинантные клоны, дикий тип погибает. • Доминантными селективными маркерами могут также служить бактериальный ген резистентности к гигромицину (hph) и ген млекопитающих, кодирующий устойчивую к метатрексату (метаболический антибиотик) форму дигидрофолатредуктазы.

ТРАНСГЕННЫЕ ЖИВОТНЫЕ

Способы получения трансгенных животных • 1. Введение экзогенной ДНК в организм взрослых животных. • - по технологии еx vivо • - создание условий для селективного роста трансформированных клеток (трансформирующий ген дополняется геноммаркером , придающим устойчивость к метатрексатуметаболическому антибиотику, который используется для селекции). Ген dhfr (дигидрофолатредуктаза)- ген-маркер, придающий устойчивость к метатрексату (МТх+). • 2. Трансформация стволовых клеток – • - по технологии еx vivо • - инъекции в эмбрионы мыши

Способы получения трансгенных животных (продолжение) • 3. Трансформация ооцитов животных • - по технологии еx vivо (микроинъекции) • - помещается в матку; все клетки полученного трансгенного животного содержат введенный ген, который передается по наследству. • 4. Трансформация эмбриона - получение «мозаичных мышей» • - по технологии еx vivо (проводят с помощью вектора SV 40) • - возвращается в матку

Принцип получения клона млекопитающих, использованный в опытах Яна Вильмута. Цитоплазма яицеклетки и клетки донора окрашены в разные цвета

Генная терапия подразумевает доставку терапевтической нуклеиновой кислоты в клетку с целью оказания терапевтического эффекта путем коррекции существующего отклонения или придания клеткам новых функций.

Области применения генной терапии Заболевания Тип вводимых генов Тип клеток, в которые вводится лечебный ген Тяжелый комбинированный иммунодефицит Ген аденозиндезами-назы Т-лимфоциты, стволовые клетки костного мозга Болезнь Гоше(лизосомная болезнь накопления) Ген глюкоцереброзидазы Стволовые клетки костного мозга Семейная гиперхолестеринемия Ген рецептора Гепатоциты печени Гемофилии Ген одного из факторов свертывания крови Фибробласты кожи Талассемии Гены глобулинов и их регуляторные участки Клетки костного мозга Муковисцидоз Ген регулятора трансмембранной проводимости Эпителий легкого (аэрозольное впрыскивание вектора в дыхательные пути)

Типы генотерапевтических подходов по цели воздействия по тактике введения агента по типу векторной системы позитивная ex vivo вирусные векторы негативная (в клетки) in vivo (в оргинизм) in situ (локально) невирусные векторы физические методы

Классификация генной терапии по цели воздействия • Позитивная генная терапия направлена на восстановление функции гена, экспрессия которого может быть недостаточной или отсутствовать полностью. В большинстве случаев различные методы позитивной генной терапии направлены на коррекцию поврежденного гена. • Негативная генная терапия направлена на подавление сверхактивного гена, или функции «больного» гена путем введения в клетки генетических конструкций, экспрессирующих факторы, которые тем или иным способом взаимодействуют с продуктом экспрессии нежелательного гена и нейтрализуют его вредный эффект.

Позитивная генная терапия: введение здорового гена в дефектные клетки 1. Корректирующая генная терапия Коррекция гена на уровне хромосомной ДНК (убрать больной ген или его больную часть и заменить его, или эту часть, здоровым ) Сюда относится Таргетинг - встраивание копии здорового гена в определенное место генома, что позволяет обеспечить гену истинно природный путь регуляции.

Позитивная генная терапия: введение здорового гена в дефектные клетки 2. Заместительная генная терапия внехромосомная экспрессия введенного гена при условии сохранения в клетке больного гена Генетическая конструкция представляет собой функционально активные гены - аналоги дефектных генов (терапевтические гены)

Негативная генная терапия Подавление сверхактивного гена, или функции «больного» гена путем введения в клетки генетических конструкций, которые тем или иным способом взаимодействуют с продуктом экспрессии нежелательного гена и нейтрализуют его вредный эффект. Это достигается: • подавлением функции гена на уровне м. РНК • подавлением функции гена на уровне белка

Классификация генной терапии по тактике введения агента

Типы векторных систем • 1. вирусные векторы • 2. невирусные векторы • 3. физические методы доставки

Вирусные Векторы Преимущества • Высокая эффективность трансфекции Недостатки • Иммуногенность (мутагенез, рекомбинация с ДНК-хозяина) • Ограниченный размер переносимой ДНК • Масштабирование, воспроизводство, стабильность, цена

Невирусные Векторы 1. Катионные липосомы 2. Катионные полимеры 3. Дендримеры Преимущества • Масштабирование, воспроизводство, стабильность, цена • Неограниченный размер плазмидной ДНК • Низкая иммуногенность Недостатки • Низкая эффективность доставки

Физические методы При использовании физических методов для доставки генов требуется сложное и дорогое оборудование, дают низкую эффективность трансфекции и имеют ограниченную область применения, но в некоторых случаях незаменимы.

Первые неудачи. . . The chill set in on 17 September 1999. That's when Jesse Gelsinger, a young volunteer, died in a gene therapy trial at the University of Pennsylvania in Philadelphia, Jesse was participating in a gene therapy trial for ornithine transcarboxylase deficiency (OTCD). He died from multiple organ failures 4 days after starting the treatment. His death is believed to have been triggered by a severe immune response to the adenovirus. Безопасность использования carrier. аденовирусных и ретровирусных векторов остается не очевидной

Проникновение в клетку

Негативная генная терапия Что такое антисмысловая терапия? (

Отличие между генной (антисмысловой) терапией и традиционной химиотерапия Генная Терапия Традиционная терапия Действующее начало Нуклеиновые кислоты Малые молекулы, пептиды Доставка Обычно требуют доставки в клетку или в ядро Действует на клеточную мембрану или диффундирует в клетку Механизм Направлены на устранение причины заболевания Обычно устраняют симптомы и признаки Время действия Может быть постоянным Единовременный эффект Этические нормы Обычно отсутствуют Являются предметом споров

Три главных вопроса генной (антисмысловой) терапии • 1. Что доставлять? • 2. Как доставлять? • 3. Куда доставлять?

Какие объекты можно доставить в клетку 1. Плазмидная ДНК 2. Олигодезоксинуклеотиды 3. si. RNA 4. Рибозимы и ДНКзимы 5. Аптамеры 6. PNAs

Плазмидная ДНК Дизайн (стоимость 5 mg составляет около 500$) 1. Промотор (CMV, промотор креатинкиназы человека) 2. Энхансер (CMV, ген иммуноглобулинов) 3. поли. А, сплайсинг-регионы 4. интроны

Плазмидная ДНК Применение 1. Заместительная терапия 2. ДНК-иммунизация 3. Ген «суицида» Клинические исследования 1. Общий имунодефицит (аденозиндезаминаза, 1990 г. ) 2. Муковисцидоз (трансмембранный проводящий белок) 3. Онкология (Gendicine (2003 г. ), p 53, регрессия опухоли у 2/3 волонтеров в поздней стадии) 4. Вакцинация (малярия, геморрагическая лихорадка)

Олигодезоксинуклеотиды Антисмысловые олигонуклеотиды Антигенные олигонуклеотиды

Олигодезоксинуклеотиды

Олигодезоксинуклеотиды Фомивирсен натрия – первый препрат разрешенный в США и Европе для лечения ретинита, вызываемого CMV-инфекцией. Фомивирсен представляет собой фосфоротиоатный олигонуклеотид, содержащий 21 нуклеотид следующей последовательности: 5'-GCG TTT GCT CTT CTT GCG-3'

si RNA – малые интерферирующие РНК