Генетическая инженерия в биотехнологии Лекция 6

Генетическая инженерия в биотехнологии. Лекция № 6

Генная инженерия – это молекулярное клонирование или технология рекомбинантных ДНК. Это совокупность экспериментальных процедур, которые позволяют переносить генетический материал из одного организма в другой. Организмы, полученные при помощи генно-инженерных манипуляций, называют трансгенными или генетически модифицированными.

История развития генной инженерии можно условно разделить на три этапа. Первый этап - конструирование векторных молекул. На этом этапе было доказано: 1. Возможность создания рекомбинантных молекул с использованием исходных молекул ДНК от различных видов и штаммов бактерий. 2. Их жизнеспособность. 3. Стабильность. 4. Функционирование.

Второй этап – получение рекомбинантной молекулы ДНК между хромосомными генами прокариот и различными плазмидами, доказательством их стабильности и жизнеспособности. Третий этап – начало работ по включению в векторные молекулы ДНК генов эукариот (растений и животных).

Дата рождения генной инженерии – 1972 год. В этом году Пол Берг и его сотрудники создали первую рекомбинантную молекулу ДНК. Инструментами стали 2 типа ферментов – рестриктирующие эндонуклеазы (для получения однородных фрагментов) и лигазы (для их соединения).

Ферменты, которые применяются для конструирования рекомбинантных ДНК делятся на следующие группы: 1. Рестриктирующие эндонуклеазы (осуществляют фрагментаци ю ДНК. 2. ДНК – лигазы (сшивают фрагменты ДНК). 3. Нуклеазы (осуществляют изменение структуры концов фрагментов ДНК) 4. ДНК-полимеразы (применяются для приготовления гибридизациолнных проб).

Важное значение в методах генной инженерии имеет секвенирование ДНК.

Секвенирование (sequencing) – это общее название методов, которые позволяют установить последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК. В настоящее время нет ни одного метода секвенирования, который бы работал для молекулы ДНК целиком; все они устроены так: сначала готовится большое число небольших участков ДНК (клонируется молекула ДНК многократно и «разрезается» её в случайных местах), а потом читается каждый участок по отдельности.

Клонирование происходит либо просто выращиванием клеток в чашке Петри, либо (в случаях, когда это было бы слишком медленно или по каким-то причинам не получилось бы) при помощи так называемой полимеразной цепной реакции. В кратком и неточном изложении работает она примерно так: сначала ДНК денатурируют, т. е. разрушают водородные связи, получая отдельные нити.

Затем к ДНК присоединяют так называемые праймеры; это короткие участки ДНК, к которым может присоединиться ДНК-полимераза – соединение, которое, собственно, и занимается копированием (репликацией) нити ДНК. На следующем этапе полимераза копирует ДНК, после чего процесс можно повторять: после новой денатурации отдельных нитей будет уже вдвое больше, на третьем цикле – вчетверо, и так далее.

Все эти эффекты достигаются в основном с помощью изменений температуры смеси из ДНК, праймеров и полимеразы; для наших целей важно, что это достаточно точный процесс, и ошибки в нём редки, а на выходе получается большое число копий участков одной и той же ДНК. Разные методы секвенирования отличаются друг от друга не методами клонирования, а тем, как потом прочесть получившийся «суп» из многочисленных копий одной и той же ДНК.

Секвенирование по Сэнгеру Первым методом секвенирования, который учёные сумели применить для обработки целых геномов (в том числе генома человека), стало секвенирование по Сэнгеру (Sanger sequencing). Смысл таков: участок ДНК клонируется, после чего полученная смесь делится на четыре части. Каждая часть помещается в активную среду, где присутствуют:

1. ДНК-полимераза, которая, как мы уже выяснили, занимается репликацией, 2. Праймеры, необходимые для начала процесса репликации, 3. Смесь всех четырёх нуклеотидов, которые будут служить «кирпичиками» для строительства новых копий ДНК, 4. Специальные вариации одного из нуклеотидов (ровно один вид нуклеотидов для каждой части), которые прекращают дальнейшее копирование молекулы ДНК.

Процесс практически идентичен клонированию ДНК, с которым мы встретились в предыдущем разделе. Разница только в том, что теперь в один из нуклеотидов подмешаны «ложные» нуклеотиды; они могут образовать точно такую же водородную связь, но не могут продолжить свою нить дальше.

Гены получают одним из трёх способов: 1. Непосредственное выделение из природного источника. 2. Получение дезоксиполинуклеотидных реплик (к. ДНК) путём копирования м. РНК. 3. Химический синтез.

Ген содержит только последовательность, необходимую для синтеза полипептидной цепи, но не имеет системы сигналов, управляющей его действием в клетке. Систему исследователь создаёт в виде вектора – циклической дезоксиполинуклеотидной молекулы, содержащей сигналы репликации и транскрипции. Сочетание генов и векторов даёт рекомбинантную молекулу ДНК.

Свойства вектора необходимо подгонять к особенностям клетки, в которую введена рекомбинантная молекула ДНК. Вектор содержит генетические маркеры, по которым ведут селекцию генетически модифицированных клеток. Особый интерес представляют собой плазмиды, обеспечивающие экспрессию включенных в них генов.

Обычно в клетке плазмидные векторы поддерживаются в количестве 25 – 50 копий. Температурно чувствительные мутантные плазмиды могут накопиться в клетке в количестве до 2000 копий. Это может привести к сверхсинтезу продуктов, кодируемых плазмидным геномом.

Процесс переноса генов включает пять основных этапов: 1. Получение фрагментов ДНК (генов). 2. Создание рекомбинантной генетической конструкции. 3. Введение ДНК в клетку –хозяина. 4. Идентификация и отбор клеток, несущих рекомбинантную ДНК. 5. Анализ экспрессии перенесённого гена в ДНК-клетку хозяина.