ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ в клинической лабораторной практике Заведующий кафедрой клинической лабораторной диагностики Копылов Юрий Николаевич
Взятие пробы крови При венозном взятии крови, которому отдается предпочтение, игла должна быть достаточно большого диаметра и иметь короткий срез, чтобы не травмировать противоположную стенку вены и избежать гемолиза. При наложении жгута давление в вене должно обеспечивать минимальный стаз, при котором клетки не повреждаются.
Общеклинический анализ крови 1. Подсчет клеток крови 2. Дифференцировка лейкоцитов Эритроциты Лейкоциты Тромбоциты Нейтрофилы Эозинофилы Лимфоциты Моноциты Базофилы 3. Определение концентрации гемоглобина 4. Определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ) 3
Показатель гематокрита Гематокрит (НСТ hematocrit, гематокритная величина) отражает долю объема крови, занимаемую эритроцитами; выражается в процентах или в виде индекса в системе СИ (л/л). Тест включает в себя центрифугирование образца крови с добавлением антикоагулянта в стандартном капилляре и измерение высоты столбика эритроцитов. Для определения гематокрита применяются как микро , так и макрометоды. Наиболее распространен центрифужный способ с использованием гематокритных центрифуг, например, с применением микроцентрифуги МЦГ 8, которая дает очень высокие обороты и укомплектована капиллярными трубками и отсчетной шкалой. При макрометоде центрифугирование проводят при 3000 об/мин в течение 30 мин. Расчетным путем гематокритный показатель определяют путем умножения среднего объема эритроцитов на число эритроцитов в крови. Этот способ наиболее часто применяется на автоматических анализаторах крови.
Разделение крови
СОЭ RBC = 4, 2 x 1012/л RBC = 3, 0 x 1012 /л
Определение концентрации гемоглобина • Гемоглобин - интенсивно окрашенный протеин, и эта особенность используется для определения его концентрации. • В качестве наиболее надежного и стандартного способа измерения рекомендуется цианметгемоглобиновый метод. • Реакция завершается очень быстро, а полученная окраска сохраняет устойчивость на протяжении 48 ч. После проведения реакции (обычно через 10 мин) концентрацию гемоглобинцианида определяют в спектрофотометре при 540 им. При тех же условиях измеряют стандартный раствор, а затем вычисляют концентрацию гемоглобина. Этот показатель выражают в г/дл или в г/л.
Методика подсчета количества эритроцитов Для подсчета эритроцитов можно воспользоваться безмеланжерным методом. При этом кровь берут микропипеткой от гемометра (до метки 0, 02 мл) и выдувают в пробирку с 3, 98 мл 1 % раствора хлористого натрия. После промывания пипетки смесь тщательно встряхивают. Каплю смеси вносят в счетную камеру Камера Горяева для микроскопического исследования клеток крови
Сетка Горяева и порядок передвижения сетки при подсчете эритроцитов (А) и лейкоцитов (Б)
Подсчет количества эритроцитов По числу эритроцитов, имеющихся в 80 малых квадратах, вычисляют количество их в 1 мм 3 крови. Для вычисления пользуются формулой: где х искомое количество эритроцитов; а сумма эритроцитов, сосчитанных в 5 больших квадратах; б количество сосчитанных малых квадратов; в разведение крови (в 200 раз); 4000 множитель, приводящий объем столбика жидкости в границах малого квадрата (1/4000 мм 3) к 1 мм 3. Пример. В 5 больших квадратах (80 малых) сосчитано 456 эритроцитов. т. е. сумму эритроцитов, сосчитанных в 5 больших квадратах, нужно умножить на 10000.
Подсчет количества лейкоцитов Количество лейкоцитов в 1 мм 3 крови вычисляют по формуле: где х искомое количество лейкоцитов; а сумма лейкоцитов, сосчитанных в 100 больших квадратах; б количество сосчитанных малых квадратов (1 большой квадрат равен 16 малым); в разведение крови (в 20 раз). Объем малого квадрата равен 1/4000 мм 3 (1 сторона 1/20 мм; высота 1/10 мм. Объем равен 1/20× 1/10 = 1/4000 мм 3). Поэтому для приведения к 1 мм 3 формула содержит множитель 4000. Пример. В 100 больших (1600 малых) квадратах сосчитано 150 лейкоцитов. В 1 мм 3 будет: т. е. сумму лейкоцитов, сосчитанных в 100 больших квадратах, нужно умножить на 50.
ПОДСЧЕТ ТРОМБОЦИТОВ РУЧНЫМ МЕТОДОМ В КАМЕРЕ ГОРЯЕВА. ПРОВЕДЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ Для подсчета тромбоцитов предпочтительнее использовать венозную кровь. В качестве антикоагулянта рекомендуется применять ЭДТА. При взятии капиллярной крови из пальца высока вероятность агрегации тромбоцитов. Перед исследованием необходимо убедиться в отсутствии сгустков крови. Исследуемую кровь разводят в 200 раз, для этого в сухую пробирку набирают 4 мл реагента и 0, 02 мл крови. Перемешивают и оставляют на 20 30 мин для гемолиза эритроцитов. Подготавливают камеру Горяева и заполняют ее перемешанной разведенной кровью с реагентом. Счетную камеру помещают во влажную среду (чашка Петри с влажной фильтровальной бумагой) на 5 мин для оседания тромбоцитов. Используется объектив 40 х, производят подсчет тромбоцитов в 25 больших квадратах счетной камеры. Тромбоциты выглядят как мелкие, хорошо преломляющие свет образования. Расчет числа тромбоцитов в 1 мкл крови производят по формуле: а х 200 а х 250 х200 Х = = а х 2000, 25 х 250¯¹ 25 где Х число тромбоцитов в 1 мкл крови, а число тромбоцитов, сосчитанных в 25 больших квадратах счетной камеры, 200 разведение крови, 25 число больших квадратов, 250ˉ¹мм объем одного большого квадрата. Практически число сосчитанных тромбоцитов умножают на 2000. В пересчете на 1 л крови умножают на 1000000. Примечание. Вся используемая стеклянная посуда и камера Горяева должны быть тщательно вымыты, иначе грязевые и пылевые частицы, сходные по размеру с тромбоцитами, могут быть ошибочно учтены при подсчете. Приготовление краски. ЭДТА — 0. 5 г. метиленовый синий — 10 мг, изотонический раствор натрия хлорида — 100 мл. Все компоненты тщательно смешивают и фильтруют. Хранят при 4 "С. Вместо метиленового синего можно использовать бриллиантовый синий, азур II. толуидиновый синий.
Ретикулоциты являются молодыми формамиэритроцитов, и в небольшом количестве присутствуют в периферической крови здорового человека. Норма ретикулоцитов: 0, 2 1, 2% от общего количества эритроцитов. Также как и эритроциты, Р. несут в себе гемоглобин, обеспечивающий транспорт килорода к тканям. Данный показатель входит в клинический анализ крови и отражает функциональную активность красного ростка костного мозга. Снижение количества ретикулоцитов свидетельствует о замедлении эритропоэза, увеличение – активизации последнего.
Последовательность действий при изготовлении мазка крови
палочкоядерный нейтрофил сегментоядерный нейтрофил эозинофилы базоофилы лимфоциты томбоциты
Лейкоцитарная формула Лейкоциты, 109 /л Эозинофилы, % Базофилы, % Нейтрофилы, % юные 4, 0 - 9, 0 1 – 4(5) 0 - 0, 5 палочкоядер ные 0 - 1 2 - 5 Лимфоциты, % Моноциты, % Сегментоядерные 55 - 68 25 - 40 2 - 8
АВТОМАТИЗАЦИЯ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
ЗАЧЕМ НУЖНА АВТОМАТИЗАЦИЯ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ? • Повышение точности результатов исследований; • Возможность получения новых диагностических показателей; • Повышение производительности работы лаборантов; • Повышение уровня доверия клиницистов; • Улучшение рабочей атмосферы в КДЛ.
РАБОЧЕЕ МЕСТО ВРАЧА ГЕМАТОЛОГА НА БАЗЕ КОМПЬЮТЕРНОГО МИКРОСКОПА уникальная разработка отечественных ученых Позволяет проводить детальный качественный и количественный анализ микроскопических препаратов
Сканирующая микроскопия
Так выглядят клетки крови на снимке, сделанном в сканирующем электронном микроскопе
Так выглядят клетки крови на снимке, сделанном в сканирующем электронном микроскопе
ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ АНАЛИЗАТОРЫ СХЕМА ОСНОВНОГО УЗЛА ГЕМАТОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗАТОРА НАСОС ЭЛЕКТРОД РЕГИСТРАЦИЯ ИМПУЛЬСОВ МИКРООТВЕРСТИЕ ДАТЧИКА ЭЛЕКТРОД РАЗВЕДЕННАЯ ПРОБА КРОВИ
ПРОХОЖДЕНИЕ ЭЛЕКТРИЧЕСКОГО ТОКА ЧЕРЕЗ АППЕРТУРУ ДАТЧИКА I I t t
ПРИНЦИП РАБОТЫ АМПЛИТУДНОГО ДИСКРИМИНАТОРА СИГНАЛ С ДАТЧИКА 0 3 7 8 4 2 1 0 0 0 1 4 15 14 10 6 4 1 ЯЧЕЙКИ ПАМЯТИ ДИСКРИМИНАТОРА ТРОМБОЦИТЫ ГИСТОГРАММА РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ЭРИТРОЦИТЫ 0 0
СИСТЕМА ОЧИСТКИ АППЕРТУРЫ 1. ПРОПУСКАНИЕ ЧЕРЕЗ АППЕРТУРУ ДАТЧИКА РАСТВОРА, СОДЕРЖАЩЕГО ДЕТЕРГЕНТЫ. 2. ПРОПУСКАНИЕ ИМПУЛЬСА ТОКА ЧЕРЕЗ АППЕРТУРУ ДАТЧИКА ПРИВОДИТ К ФОРМИРОВАНИЮ МИКРОВЗРЫВА И ОЧИСТКИ ПОВЕРХНОСТИ АППЕРТУРЫ.
Весь ряд гематологических анализаторов по виду выполняемых исследований можно разделить на четыре типа • К первому типу относятся приборы, выполняющие анализ по небольшому числу показателей, обычно по 6– 8, и без дифференцирования лейкоцитов на субпопуляции. • Ко второму классу следует отнести так называемые 3 DIFF системы, способные дифференцировать лейкоциты на 3 субпопуляции, позволяющие определять до 18 параметров • К третьему классу относятся так называемые 5 DIFF системы, способные дифференцировать лейкоциты на 5 популяций и позволяющие определять до 28 параметров. • Четвертый класс – анализаторы с модулем дифференцирования ретикулоцитов. Общее количество параметров, определяемых анализаторами с таким модулем доходит до 40.
Возможность получения новых диагностических показателей Гематологические анализаторы позволяют определять: традиционные показатели: Эритроциты, Лейкоциты, Тромбоциты, Гемоглобин, Гематокрит. Новые показатели: Средний объем эритроцитов (MCV), Среднее содержание гемоглобина в эритроцитах (MCH), Средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах (MCHC), Коэффициент вариации объема эритроцитов (RDV) Средний объем тромбоцитов (MPV), Тромбокрит (PCT)
WBC (количество лейкоцитов), RBC (количество эритроцитов), HGB (гемоглобин), НСТ (гематокрит), MCV (средний корпускулярный объем эритроцита), МСН (среднее содержание гемоглобина в эритроците), МСНС (средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах); RDW (ширина распределения эритроцитов по объему), PLT (количество тромбоцитов), MPV (средний объем тромбоцитов), РСТ (тромбокрит). PDW (ширина распределения тромбоцитов по объему, LYC (лимфоциты, % и содержание в 103 кл/мм 3), MON (моноциты, % и содержание в 103 кл/мм 3; GRA (гранулоциты, % и содержание в 103 кл/ мм 3),
Количество эритроцитов крови RBC (red blood cells) RBC количество эритроцитов крови (х1012/л). Коэффициент вариации данного параметра составляет 1 2%, в некоторых приборах менее 1%. К эритроцитам относятся все частицы размером более 36 фл. Поскольку размеры лейкоцитов близки к размерам эритроцитов, они неизбежно будут влиять на подсчет числа эритроцитов. Однако за исключением явных лейкоцитозов (>50 х109/л), это влияние будет незначительным, так как в норме количество эритроцитов в крови в тысячи раз превышает число лейкоцитов. В случаях гиперлейкоцитоза ошибка измерения эритроцитов возрастает
Гематокрит HCT (hematocrit) – • Показатель отражает долю объема крови, занимаемую эритроцитами; выражается в %; • Вычисляется как сумма прямо измеренных объемов эритроцитов в единице объема крови по формуле: RBC x MCV. Коэффициент вариации для автоматического метода менее 1%.
Определение размеров эритроцитов Средний объем эритроцита (MCV- mean corpuscular volume) средний объем эритроцита, выражается в кубических микрометрах (мкм 3) или в фемтолитрах (1 фл = 1 мкм 3 или 1 х10 15/л). MCV является измеряемым показателем, он определяется большинством гематологических анализаторов благодаря прямой зависимости амплитуды электрического импульса от объема клетки. Вычисляется MCV делением суммы клеточных объемов на число эритроцитов. На практике (без геманализатора) средний объем эритроцита вычисляют путем умножения гематокрита (%) на 10 и деления полученного произведения на число эритроцитов в миллионах в кубическом миллиметре крови:
Среднее содержание гемоглобина в эритроците (МСН) МСН устанавливается по формуле: Гемоглобин (г/ 1. 00 мл) х 10 МCH = --------------------- (норма составляет 27 -31 пг. ) Число эритроцитов ( млн. /мкл) Результат выражают в пикограммах (пг), норма составляет 27 31 пг. Этот показатель характеризует среднее содержание гемоглобина в отдельном эритроците. Он аналогичен цветовому показателю, который входит в общий анализ крови и широко используется в клинике. На основе этих индексов анемии разделяют на нормо , гипо и гиперхромные.
Цветовой показатель (ЦП) ЦП относительная величина, характеризующая среднее содержание гемоглобина в эритроците. Формула для вычисления цветового показателя имеет вид: Гемоглобин (г/л) х 3 ЦП = Первые три цифры содержания эритроцитов В норме ЦП составляет 0, 86 1, 05. Этот показатель имеет та кую же клиническую интерпретацию, как среднее содержание гемоглобина в эритроците. Однако, цветовой показатель определяется в условных единицах, поэтому имеет отвлеченное значение.
Средняя концентрация гемоглобина в эритроците (МСНС) вычисляется путем деления концентрации гемоглобина в г/100 мл на гематокрит и умножения на 100: Гемоглобин ( г /дл) МCHC = --------------- x 100. (в норме составляет 30 -37 г/дл. ) Гематокрит (%) Выражается этот индекс в г/дл. Различия между двумя последними индексами должны быть понятны. Первый показатель указывает на массу гемоглобина в среднем эритроците и выражается в долях грамма. (пикограммах). Второй индекс показывает концентрацию гемоглобина в среднем эритроците, т. е. соотношение содержания гемоглобина к объему клетки.
Ширина распределения эритроцитов по объему (RDW - red cell distribution width). RDW вычисляют по коэффициенту вариации эритроцитометрической кривой и выражают в процентах. • Этот показатель вычисляется большинством современных гематологических анализаторов на основании гистограммы распределения эритроцитов, как коэффициент вариации (CV) объема эритроцитов: • где SD – стандартное среднеквадратическое отклонение объема эритроцита от среднего значения У здоровых людей этот показатель варьирует от 11, 5% до 14, 5%. Показатель анизоцитоза (RDW) характеризует неоднородность размеров эритроцитов значительно точнее, чем это можно получить при визуальной оценке мазка крови, измерении среднего диаметра эритроцитов и построении кривой Прайс Джойса. Оценка степени анизоцитоза под микроскопом сопровождается целым рядом ошибок. При высыхании эритроцитов их диаметр уменьшается на 10 20%, в толстых мазках он меньше, чем в тонких. В отличии от морфологических методов оценки анизоцитоза автоматизированный кондуктометрический подсчет обладает более высокой точностью и воспроизводимостью результатов.
Эритроцитарная гистограмма • Эритроцитарная гистограмма графическое распределение клеток по их количеству и объему. • Как правило, регистрируемая кривая подчиняется закону нормального (гауссова) распределения. Гистограмма должна начинаться и заканчиваться на базовой линии и между нижним и верхним дискриминатором. По горизонтали откладывается объем измеряемой клетки в фл (1 фл=10 15 /л), вертикальная ось на графике фиксируется как 100% шкала. Нормальная эритроцитарная гистограмма имеет симметричную (куполообразную) форму. При появлении патологических или нескольких популяций эритроцитов форма гистограммы меняется. • Несмотря на то, что пороговое значение для эритроцитов составляет 36 фл, дополнительная область от 24 до 36 фл позволяет выявить клетки небольших размеров.
Средний объем тромбоцитов (MPV-mean platelet volume) выражается в фемтолитрах (фл) или кубических микронах (мкм'). В норме этот показатель варьирует от 7, 4 до 10, 4 фл и имеет тенденцию к увеличению с возрастом: с 8, 6 8, 9 фл у детей 1 5 лет до 9, 5 10, 6 фл у людей старше 70 лет. "Молодые" кровяные пластинки имеют больший объем, поэтому при ускорении тромбоцитопоэза средний объем тромбоцитов возрастает.
Ширина распределения тромбоцитов по объему (PDW-platelet distribution width) • PDW измеряется в процентах (коэффициент вариации тромбоцитометрической кривой) и количественно отражает гетерогенность популяции этих клеток по размерам (степень анизоцитоза тромбоцитов). • В норме этот показатель составляет 10 -20%.
Тромбокрит (РСТ-platelet Grit) • Тромбокрит (РСТ) является параметром, который отражает долю объема цельной крови, занимаемую тромбоцитами. Он аналогичен гематокриту и выражается в процентах. • В норме тромбокрит составляет 0, 15 0, 40%.
Лейкоцитарные параметры • WBC (white blood cells) - количество лейкоцитов крови (х109/л). Измерение числа лейкоцитов проводится после полного лизиса эритроцитов специальным реактивом. Все частицы размером более 35 фл считаются как лейкоциты. Тромбоциты, размер которых меньше порогового значения 35 фл, исключаются из подсчета. Коэффициент вариации (CV) при автоматическом определении этого показателя составляет 2 3%.
Подсчет лейкоцитарной формулы Многие современные гематологические анализаторы определяют от 6 до 10 показателей лейкоцитарной формулы с учетом относительного и абсолютного количества клеток, так называемые 3 Diff или 5 Diff
Гематологические анализаторы, определяющие 18 параметров крови, дифференцируют все WBC на три популяции (3 Diff). В основе работы анализаторов 3 Diff лежит принцип кондуктометрии. Клетки дифференцируются по объему на 3 категории: лимфоциты, нейтрофилы и средние клетки, состоящие преимущественно из моноцитов с добавлением эозинофилов и базофилов. Определяется как относительное (%), , так и абсолютное их содержание (клетки/л).
Автоматические гематологические анализаторы, определяющие 26 и более параметров крови, дифференцируют WBC на пять популяций (5 Diff). В основе работы анализаторов 5 Diff используется комбинация кондуктометрического метода с другими технологиями, такими как: метод лазерного светорассеивания, радиочастотный анализ, использование дифференцирующих лизатов, цитохимический метод.
Скачать презентацию ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ в клинической лабораторной практике Заведующий кафедрой
95419d04e4550d8d8966e6932c73fb35.ppt