ГБОУ ВПО УГМУ Минздравсоцразвития РФ Кафедра биохимии Предмет: Клиническая биохимия биологического окисления Факультет: лечебно-профилактический. 2 курс Лектор: к. б. н. Гаврилов И. В. г. Екатеринбург, 2014
Пути использования О 2 в клетке В настоящее время выделено 4 основные пути использования О 2 в организме: 1. Оксидазный путь Функция: 90% О 2 используется для синтеза АТФ; 2. Монооксигеназный путь (Обеспечивает включение 1 атома кислорода в молекулу субстрата) Функции: ü синтез новых веществ (стероидные гормоны), ü обезвреживание ксенобиотиков и токсических продуктов обмена в митохондриях и ЭПР;
3. Диоксигеназный путь (Обеспечивает включение молекулы кислорода в молекулу субстрата) Функция: ü деградация АК; ü синтез новых веществ; 4. Свободно-радикальный путь Функции: ü внутриклеточное пищеварение; ü разрушение бактерий, вирусов, онко- и стареющих клеток; ü образование БАВ.
1. Нарушение оксидазного пути использования кислорода 1. Гипоксия - (hypoxia; греч. hypo- + лат. oxy [genium] кислород; синоним: кислородное голодание, кислородная недостаточность) – состояние, возникающее при недостаточном снабжении тканей организма О 2 или нарушением его утилизации в процессе биологического окисления. • • Многие патологические состояния приводят к развитию гипоксии Гипоксия является главной причиной смерти
Международная классификация гипоксий 1. гипоксическая гипоксия — развивается при недостаточности О 2 во вдыхаемом воздухе и в результате нарушения внешнего дыхания; 2. анемическая (гемическая) гипоксия — связана с уменьшением количества Нb в крови, обусловленным кровопотерей, гемолизом, уменьшением эритропоэза, нарушением качества Нb (наследственные талассемии, отравления СО, CN, образование Met. Hb); 3. застойная гипоксия — при недостаточности сердечнососудистой системы; 4. гистотоксическая гипоксия — при нарушениях работы ферментов окислительного фосфорилирования, вызванных повреждением мембран митохондрий, действие ингибиторов (цианиды), генетических дефектах.
Клинические проявления гипоксии Главное влияние гипоксия оказывает на ЦНС, особенно на высшие центры ЦНС. 1. острая гипоксия вызывает нарушение мышления, нарушение координации движений (сходны с алкогольным опьянением). 2. хроническая гипоксия вызывает повышенную утомляемость, сонливость, апатию, нарушение внимания, замедленную реакцию 3. тяжелая гипоксия вызывает нарушения стволовых функций, может привести к смерти от дыхательной недостаточности
Биохимические нарушения при гипоксии 1. При дефиците О 2 ПВК превращается в молочную кислоту, которая накапливается и вызывает к метаболический ацидоз. 2. значительно снижается количество энергии, получаемое при катаболизме питательных веществ, что приводит к снижению синтеза макроэргических фосфатов и нарушению функции клеток.
Гистотоксическая гипоксия 1. При пожарах, во время горении азотсодержащих материалов, образуется ряд химических соединений - цианиды, наиболее токсичным из которых является цианистый водород. 2. Цианиды ингибируют цитохромоксидазу, блокируют перенос е- в дыхательной цепи, потребление О 2 и синтез АТФ. 3. Дефицит АТФ усиливает анаэробный гликолиз, образование лактата и вызывает развитие ацидоза. 4. Ацидоз снижает р. Н, которая блокирует активность большинства анаболических ферментов, что может приводить к коме и летальному исходу. Определение цианидов занимает нескольких часов и не имеет широкого применения поскольку состояние отравления цианидами крайне опасно и требует немедленных действий.
Клиническая картина отравления цианидами 1. Смертельная доза цианистого натрия и калия составляет 200 -300 мг, синильной кислоты - 50 мг. 2. Симптомы появляются через несколько секунд после вдыхания и через несколько минут после приема внутрь. 3. Высокие дозы цианидов вызывают почти мгновенную потерю сознания и смерть. 4. При меньших дозах вначале возникают головная боль, головокружение, возбуждение, тревога, жжение в горле, жжение во рту, одышка, тахикардия, повышение АД. Часто наблюдаются тошнота, рвота, обильное потоотделение. 5. В выдыхаемом воздухе может появляется запах горького миндаля. 6. В дальнейшем развиваются кома, судороги, затем паралич, угнетение дыхания, отек легких, нарушения ритма сердца, брадикардия и снижение АД.
Анемическая (гемическая) гипоксия 1 реакция ПФШ: В цитоплазме • Дефект рецессивный, сцепленный с Х хромосомой: клиника у мужчин и у гомозиготных женщин. • Самая распространенная ферментопатия (у 300 млн человек), среди русских у 2% людей.
Существует 2 изоформы Гл-6 ф ДГ: А и В Активность Гл-6 ф ДГ А в Er сохраняется 13 дней Активность Гл-6 ф ДГ В в Er сохраняется 62 дня (> в 5 раз) Варианты недостаточности Гл-6 ф ДГ: 1. 2. 3. 4. 5. А+ (активность 90%), А”” (активность 10 -15% - Африка), В+ (активность 100% - Европа), B”” (активность 1% - Средиземноморский регион), Canton (значительно снижена - Юго-Восточная Азия). Дефицит Гл-6 ф ДГ сопровождается: 1. дефицитом НАДФН 2 (необходим для восстановления глутатиона и АОС) 2. активацией СРО, 3. гемолизом эритроцитов, 4. анемией
Классификация проявлений недостаточности глюкозо-6 -фосфат ДГ в эритроцитах • Гемолитическая болезнь новорожденных (В””, Canton). • Хроническая несфероцитарная гемолитическая анемия (Северная Европа) • Острый внутрисосудистый гемолиз. У внешне здоровых детей после приема лекарств, реже в связи с вакцинацией, вирусной инфекцией, диабетическим ацидозом. • Фавизм. Вызывает употребление в пищу конских бобов, вдыхаем цветочной пыльцы бобовых. В основном у мальчиков 1 - 5 лет. Через несколько часов – дней после контакта гемолитический криз. Продромальные признаки: слабость, озноб, головная боль, сонливость, боли в пояснице, животе, тошнота, рвота. Криз: бледность, желтуха, гемоглобинурия до нескольких дней. • Бессимптомная форма.
Лекарственные препараты, вызывающие гемолиз при недостаточности глюкозо-6 -фосфат ДГ в эритроцитах Установлено 59 потенциальных гемолитиков при дефиците гл-6 -ф ДГ 1. 2. 3. 4. 5. 6. Анальгетики и антипиретики (Ацетанилид ) Противомалярийные препараты (Пентахин, памахин, примахин, хиноцид ) Сульфаниламидные препараты (Сульфаниламид, сульфапиридин, сульфацетамид, салазо-сульфапиридин, сульфаметоксипиридазин (сульфапиридазин), сульфацил-натрий, сульфаметоксазол) Нитрофураны (Фурациллин, фуразолидон, фурадонин, фурагин, фуразолин, нитрофурантоин ) Сульфоны (Диаминодифенилсульфон, тиазольфон) Другие лекарственные препараты (Нафтолы (нафталин), фенилгидразин, толуидиновый синий, тринитротолуол, неосальварсан, налидоксовая кислота) Острый внутрисосудистый гемолиз развивается, как правило, через 48 -96 ч после приема больным лекарственного препарата
Клинические проявления острого гемолитического криза • Общее состояние ребенка тяжелое, отмечаются сильная головная боль, фебрильная лихорадка. • Кожные покровы и склеры бледно-иктеричные. • Печень чаще всего увеличенная и болезненная; селезенка не увеличена. • Наблюдаются повторная рвота с примесью желчи, интенсивно окрашенный стул. • Типичный симптом - появление мочи цвета черного пива или крепкого раствора перманганата калия. • При очень интенсивном гемолизе возможно развитие острой почечной недостаточности и ДВС-синдрома, которые могут привести к летальному исходу
• • Диагностика недостаточности глюкозо-6 -фосфат ДГ Гематология Монохромная гиперрегенераторная анемия Ретикулоцитоз (в 6 -8 раз), Анизопойкилоцитоз, Базофильная пункция эритроцитов нормоциты, полихромазия Иногда шизоциты Биохимия • в эритроцитах: низкая активность глюкозо-6 -ф ДГ • в плазме: повышение непрямого билирубина, свободного Hb, гипогаптоглобинемия В костномозговом пунктате • резкая гиперплазия эритроидного ростка
Глюкозо-6 -фосфатдегидрогеназа (G 6 P-DH) Кинетическое определение активности ПРОБЫ Свежая сыворотка, плазма и эритроциты. Не допускайте гемолиза. Стабильность: 8 часов при 2. . . 8°С. ПРИНЦИП Глюкозо-6 -ф ДГ Гл-6 -Ф + НАДФ+ → глюконат-6 -ф + НАДФН 2 Длина волны: 340 нм Активность Г 6 Ф-ДГ в сыворотке и плазме: Е/л (37°С)= АА/мин * 841 Активность Г 6 Ф-ДГ в эритроцитах: м. Е = в эритроцитах/мл крови * 33650 РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ Сыворотка/плазма: 0 -0, 18 Ед/л (МЕ/мл) Эритроциты: 118– 144 МЕ/109 эритроцитов
Диагностика гипоксий Диагностируются с помощью анализа кислотноосновного равновесия Измеряемые параметры: р. Н, р. О 2, р. СО 2, Na+, K+, Ca 2+, Cl-, общий гемоглобин (t. Hb), сатурация кислорода (s. O 2), гематокрит (Hct). Расчетные параметры: H+, c. HCO 3, ct. CO 2 (P), ct. CO 2 (B), BE, BEact, BEecf BB, ct. O 2 p. Hst c. HCO 3 -st PAO 2 RI, n. Ca 2+ Qs/Qt, P 50(c), s. O 2 (c), Aa. DO 2 a/AO 2 av. DO 2 AG, MCHC, Osm, OER, Hct(c), P/F Index, PAO 2 t RIt p. Ht PCO 2 t PO 2 t H+t Анализатор критических состояний COBAS B 121
Использование показателей КОС в диагностики гипоксии Референсные нормы КОС артериальной крови Параметр Символ Значение Диапазон H+ H+ 40 36 -44 p. H 7. 4 7. 36 -7. 44 Pa. CO 2 40 36 -44 мм рт ст BE 0 – 2 to +2 ммоль/л Общее CO 2 TCO 2 25 23 -27 ммоль/л HCO 3– 24 22 -26 ммоль/л Стандартный бикарбонат SBC 24 22 -26 ммоль/л O 2 сатурация Sa. O 2 98 95 -100 % ↓ Парциальное напряжение O 2 Pa. O 2 95 80 -100 мм рт ст ↓ Парциальное напряжение CO 2 Base exces Ед гипоксия нмоль/л -
ЛАКТАТ (lactate) Ферментативный колориметрический метод определения лактата в сыворотке. ПРОБЫ Негемолизированная сыворотка или гепаринизированная плазма. ПРИНЦИП лактатоксидаза Лактат + O 2 + H 2 O → пирувата + H 2 O 2 Пероксидаза 2 H 2 O 2 + 4 -аминофеназон + 4 -хлорфенол → кинон + H 2 O Длина волны: 505 (490 -550) нм Референсные значения 0, 99 – 1, 77 ммоль/л
ГЕМОГЛОБИН (haemoglobin) Гемиглобинцианидный метод ПРОБЫ Капиллярная кровь или венозная кровь c ЭДТА. Концентрация в пробах стабильна 7 дней при 2 -8°С или в течение 5 месяцев при -20°С. ПРИНЦИП Гемоглобин окисляется ферроцианидом калия с образованием метгемоглобина, который с цианидом калия преобразуется в цианметгемоглобин. Интенсивность окраски цианметгемоглобина при длине волны 540 нм прямо пропорциональна концентрации гемоглобина в крови Hb(Fe 2+) → Met. Hb(Fe 3+) → CNMet. Hb(Fe 3+) Референсные значения Мужчины 140 – 180 г/л 8, 7 – 11, 2 ммоль/л Женщины 120 – 160 г/л 7, 5 – 9, 9 ммоль/л
ЖЕЛЕЗО (iron (TPTZ)) Колориметрический тест (TPTZ) для количественного определения железа сыворотки. ПРОБЫ Сыворотка. Гемолиз будет давать интерференцию. ПРИНЦИП 1. В слабой кислоте железо диссоциирует из трансферрина, а сывороточные белки остаются в растворе. 2. Fe 3+ аскорбатом восстанавливается в Fe 2+ 3. Fe 2+ со специфическим цветным реагентом (трипиридил-триазин) дает голубой комплекс. Длина волны 595 нм Референсные значения Мужчины: 10, 7 – 28, 6 мкмоль/л Женщины: 7, 6 – 26, 0 мкмоль/л
2. Нарушение монооксигеназного пути использования кислорода 1. Печеночная недостаточность (недостаточность детоксикационной функции печени) 2. Желтухи новорожденных (рождение ребенка с недоразвитой печенью и высоким уровнем фетального гемоглобина)
Печеночная недостаточность • Наблюдается снижение толерантности организма к алкоголю и другим токсическим воздействиям • Определяют различные нагрузочные пробы (с бромсульфалеином, с вофавердином и др) • Накопление билирубина в крови.
Методы исследования монооксигеназных рекций • Получение с помощью ультрацентрифугирования высокоочищенных микросомальных мембран. • Одномерный и двумерный электрофорез. • Определение функциональной активности цитохромов Р 450 спектральными и флуорометрическими методами.
3. Нарушение диоксигеназного пути использования кислорода 1. Алкаптонурия
Алкаптонурия • • • При наследственном дефекте диоксигеназы гомогентизиновой кислоты (2— 5 случаев на 1 млн новорождённых) развивается алкаптонурия. При алкаптонурии происходит накопление в организме гомогентизиновой кислоты, избытки выделяются с мочой. На воздухе гомогентизиновая кислота окисляется с образованием тёмных пигментов – алкаптонов - моча окрашивается в черный цвете Алкаптон откладывается в хрящевой и другой соединительной ткани, обусловливая их потемнение и повышенную хрупкость. Чаще всего вперёд появляется пигментация склер и ушных хрящей.
Диагностика алкаптонурии 1. Информативный способ - количественное определение гомогентезиновой кислоты и бензохиноуксусной кислоты в моче методом ферментативной спектрофотометрии или жидкостной хроматография. 2. Менее точный способ - оценка цвета мочи через 12 -24 ч после пребывания её на воздухе: окисление алкаптона приводит к изменению цвета мочи (становится бурой или чёрной). Данные изменения происходят только при щелочных значениях р. Н мочи. 3. Диагноз «алкаптонурия» может быть установлен при выявлении характерной пигментации хряща в ходе артроскопии, синовиальной оболочки во время микроскопического исследования или клапанов сердца в ходе их протезирования. Важно разграничить генетическую алкаптонурию от алкаптонурии при гиповитаминозе С. Последняя исчезает после назначения адекватной дозы аскорбиновой кислоты. Следует отличать алкаптонурию от гематурии, гемоглобинурии, меланинурии, порфирии.
4. Нарушение свободно-радикального пути использования кислорода 1. Оксидативный стресс Оксидативным стрессом называют процесс повреждения клетки в результате реакций окисления. У человека оксидативный стресс является причиной или важной составляющей серьезных (>60) заболеваний, таких как атеросклероз и болезнь Альцгеймера, а также старения.
Активация ПОЛ сопровождается «выгоранием» ФЛ мембран, повышением их проницаемости и разрушением, ингибированием ферментов, нарушением работы ДНК, что ведет к подавлению клеточной пролиферации, повышению гемолиза эритроцитов, ускорению темпа старения и гибели организма
Лабораторные показатели ПОЛ Набор реагентов для определения Супероксиддисмутазы (Cu/Zn. SOD), методом ИФА, 96 тестов Набор реагентов для определения Oxystat (количественное определение перекиси), методом ИФА, 96 тестов Набор реагентов для определения Миелопероксидазы, методом ИФА, 192 тестов Набор реагентов для определения Гем-оксигеназа, методом ИФА, 96 (в лизате клеток) • • • МДА –малоновый диальдегид ДК – диеновые конъюгаты ГП – гидроперекиси ХЛ – хемилюминесценция Шиффовы основания
Люминометр - фотометр Lucy 3 (Anthos Labtec Instruments) США и анализатор АОА
Лабораторные показатели АОА • Активность антиокислительных ферментов • Витамины С, Е, А • Мочевая кислота • Глутатион • Церулоплазмин • Трансферрин • Ферритин • Лактоферрином
Классификация препаратов антиоксидантов 1. Антирадикальные средства 1. 1. Эндогенные соединения • α-Токоферол (Витамин Е), • β-Каротин (Провитамин А), • Ретинол (Витамин А), • кислота аскорбиновая (Витамин С), • глутатион восстановленный (Татионил), Кислота α-липоевая (Тиоктацид), • Карнозин, • Убихинон (Кудесан)
1. 2. Синтетические препараты • • • Ионол (Дибунол), Тиофан, Мексидол, Ацетилцистеин (АЦЦ), Пробукол (Фенбутол), Сукцинобукол (AGI-1067), Диметилсульфоксид (Димексид), Тирилазад мезилат (Фридокс), Эмоксипин, Олифен (Гипоксен), Эхинохром-А (Гистохром), Церовив (NXY-059)
2. Антиоксидантные ферменты и их активаторы 2. 1. Препараты супероксиддисмутазы - Эрисод, Орготеин (Пероксинорм) 2. 2. Препараты ферроксидазы церулоплазмина (Церулоплазмин) 2. 3. Активаторы антиоксидантных ферментов- Натрия селенит (Селеназа) 3. Блокаторы образования свободных радикалов- Аллопуринол (Милурит), Оксипуринол, Антигипоксанты
Фрукты и овощи - самые мощные антиоксиданты Jean Carper "Vour Miracle Brain", Harper Colleni Publisher. 2000, pp. 152 -153 • Фрукт или овощ ORAC на 5 кг Одна порция ORAC на 1 порцию ====================== Чернослив _______ 288500 1 ч/слив без кост 462 Изюм ______ 141500 1/4 чашки 1019 Черника_____ 111700 1/2 чашки 1620 Черная смородина 101800 1/2 чашки 1466 Чеснок_____ 96950 1 долька 58 Капуста (вареная) 88500 1/2 чашки 1150 Клюква_____ 87500 1/2 чашки 831 Клубника_______ 76800 1/2 чашки 831 Шпинат (сырой)__ 60500 1 чашка 678 Малина_____ 61300 1/2 чашки 755 Брюссельская кап 51300 1 проросток 206 Сливы_____ 47450 1 слива 626 Люцерна пророст_ 46550 1 чашка 307 Шпинат (туш. )__ 45450 1/2 чашки 1089 Цветки брокколи_ 44500 1/2 чашки вареные 817 Свекла (вареная) 42050 1/2 чашки 715 Авокадо____ 39100 1/2 штуки 149 Апельсин_______ 37500 1 штука 982 Виноград (красн. ) 36950 10 виноградин 177 Перец (красн. )__ 36550 1 средний перец 540 Вишни_____ 33500 10 вишен 455 Киви______ 30250 1 штука 458
Спасибо за внимание !
Скачать презентацию ГБОУ ВПО УГМУ Минздравсоцразвития РФ Кафедра биохимии Предмет
Клиническая+биохимия+Лекция+3.+БО+2014.ppt