ГБОУ ВПО Тюменская государственная медицинская академия

ГБОУ ВПО Тюменская государственная медицинская академия Кафедра микробиологии Генетика микроорганизмов Лекция № 5

План 1. Строение генома бактерий 2. Подвижные генетические элементы 3. Виды изменчивости бактерий 4. Генная инженерия

Генетика микроорганизмов • Генетика микроорганизмов - это раздел общей генетики, в котором объектом исследования служат вирусы, бактерии, микроскопические грибы, бактериофаги и другие микроорганизмы.

Генетика микроорганизмов изучает закономерности наследственности и изменчивости, механизмы формирования лекарственной резистентности, вопросы генной инженерии и биотехнологии.

Генетический аппарат бактерий 1. Нуклеоид 2. Плазмиды 3. Транспозоны 4. «Геномные острова» ( «Острова патогенности» ) Ген – фрагмент молекулы ДНК, контролирующий синтез одного белка или пептида Генотип – совокупность всех генов, присущих данному организму : структурных (цистронов) и регуляторных Фенотип – совокупность реализованных у организма генетически детерминированных признаков

Нуклеоид (бактериальная хромосома) ü плотно упакованная двухцепочечная молекула Это ДНК кольцевой формы üМасса (E. coli) до 5 106 пар нуклеотидов (п. н. ) üДНК суперспирализована и содержит до 4 тыс. генов üДНК не отграничена от цитоплазмы мембраной üСвязана с определенными рецепторами на ЦПМ üОбласть нуклеоида не содержит рибосом üРепликация протекает по полуконсервативному механизму «Тень» E. сoli после осмотического шока и высвобождения ДНК

§ Поскольку длина хромосомы во много раз превышает длину бактериальной клетки (1, 5 -3, 0 мкм), хромосома компактным образом в ней упакована: молекула хромосомной ДНК находится в суперспирализованной форме и свернута в виде петель, число которых 12 -80 на хромосому. § Бактериальная хромосома имеет гаплоидный набор генов.

Генетическая карта хромосомы E. Coli

• Воспроизведение генетического материала бактерий осуществляется в процессе репликации (воспроизведения) • Репликация бактерий протекает по полуконсервативному механизму

Репликация ДНК Цепочки ДНК расходятся и на каждой матрице формируется новая цепь ДНК. Во вновь образующейся ДНК одна нить остается старой, а другая – новой, такой способ репликации получил название полуконсервативного. В результате образуется две абсолютно идентичные молекулы ДНК

ДНК

Транскрипция генетического материала • Транскрипция ( считывание) – процесс, посредством которого заключенная в ДНК генетическая информация переписывается в одиночные цепи м. РНК. • Хромосома бактерий состоит из функциональных единиц транскрипции – оперонов. 1 оперон кодирует синтез 1 молекулы м. РНК • Оперон состоит из цистронов, промотора, оператора и терминатора.

Транскрипция генетического материала • Промотор содержит участок первоначально прочного связывания ДНК-зависимой РНК-полимеразы с ДНК. • Оператор – регуляторный участок, который связывается с репрессорами – белками, контролирующими синтез м. РНК в соответствии с потребностями клетки.

Регуляция выражения генетической информации у бактерий • Опероны, кодирующие синтез индуцибельных и репрессируемых ферментов, функционируют не постоянно, а в соответствии с потребностями клетки • Опероны, отвечающие за синтез конститутивных ферментов, работают регулярно (не содержат активно действующего оператора)

Лактозный оперон Е. сoli СТРУКТУРНЫЕ ГЕНЫ

Нехромосомные генетические элементы 1. Плазмиды 2. Транспозоны 3. IS-последовательности

Плазмиды Это независимые от бактериальной хромосомы фрагменты ДНК (от 1 т. п. н. до нескольких сотен т. п. н. ) замкнутые в кольцо У Streptomyces spp. , Borrelia spp. и Rhodococcus spp. плазмиды линейные Эписома (или интегративная плазмида) – плазмида, способная обратимо встраиваться в бактериальную хромосому Электронограмма плазмиды E. coli

Плазмиды бывают: ØИнтегрированные или эписомы - способны обратимо встраиваться в бактериальную хромосому. Самостоятельно не перемещаются из клетки в клетку и не реплицируются

Плазмиды ØКонъюгативные (трансмиссивные) - находятся отдельно от хромосомы. Способны к автономной репликации и к перемещению из одной клетки в другую ХРОМОСОМА ПЛАЗМИДЫ

Плазмиды распространяются среди бактерий двумя способами: 1. По вертикали – от материнской к дочерней в процессе клеточного делени 2. По горизонтали – между взрослыми особями при трансформации, трансдукции и конъюгации

Функции плазмид 1. Регуляторная – компенсация метаболических дефектов бактерии 2. Кодирующая – внесение в бактерию информации о новых признаках

Категории плазмид: Категория Свойства F-плазмиды - Кодируют синтез половых ворсинок R-плазмиды - Кодируют устойчивость к антибиотикам Col-плазмиды -Синтез колицинов (веществ, вызывающих гибель близкородственных видов) Плазмиды патогенности: а Ent-плазмиды - Синтез энтеротоксинов Hly-плазмиды - Синтез экзотоксина - гемолизина Плазмиды - Синтез адгезивных пили адгезии Плазмиды -Синтез белков, способствующих инвазии проникновению бактерий в ткани

Совокупность плазмид, входящих в состав 1 бактериальной клетки, называется плазмотипом

Подвижные генетические элементы • Транспозоны пенициллиназы • IS-элементы ГЕН ТРАНСПОЗИЦИИ

?

?

Характеристика транспозонов и IS- элементов • Входят в состав генома бактерий • Функционирую только вместе с хромосомой • Способны перемещаться в различные участки хромосомы, переходить из хромосомы в плазмиду и обратно • Генетическая информация, содержащаяся в них, не обязательна для жизнедеятельности бактерии

Транспозоны Молекулы ДНК длиной до 20000 пар нуклеотидов, содержащие информацию для собственного перемещения, а также структурные гены

Транспозоны кодируют: 1. Синтез токсинов 2. Синтез ферментов, расщепляющих углеводы 3. Синтез ферментов, разрушающих антибиотики, что приводит к формированию в условиях стационаров госпитальных штаммов микробов

Схема действия транспозона

IS-элементы (от англ. Insertion sequences) Молекулы ДНК длиной до 1000 пар нуклеотидов, содержащие информацию только для собственного перемещения ГЕН ТРАНСПОЗИЦИИ

Функции IS-элементов: 1. Координация взаимодействия транспозонов, бактериофагов, плазмид между собой и с бактериальной хромосомой 2. Инициация транскрипции или «выключение» генов, в которые произошло встраивание этого элемента 3. Индукция мутаций

Виды изменчивости Рецептируемые Фактор условия Мутагены, возникновения окружающей ИЗМЕНЧИВОСТЬ МГЭ среды Модификационная Генотипическая Изменение/ появление новых Не закрепляются в Закрепляются в свойств генотипе поверхность морфология биохимия Фазовые Антигенная Полиморфизм Синтез Ферментативная вариации изменчивость токсина активность

Виды изменчивости 1. Фенотипическая (модификация) Временные, наследственно не закрепленные изменения, возникающие в ответ на изменение условий окружающей среды Пример: переход гонококка в L-формы под действием антибиотиков пенициллинового ряда 2. Генотипическая Возникает на уровне генотипа и передается из поколения в поколение - мутации - генетические рекомбинации

Мутации Это наследственные изменения генотипа в результате изменения нуклеотидной последовательности ДНК. 1. Точковые мутации – замена, делеция или вставка одной пары нуклеотидов. 2. Хромосомные – затрагивают множество пар нуклеотидов. По причинам возникновения мутации делят на: 1. Спонтанные 2. Индуцированные

Спонтанные мутации • Возникают без всякого вмешательства извне и случайным образом • Эти мутации происходят в «горячих точках» и в основном в генах необходимых для выживания Горячие точки: а) метилированный гуанозин б) Т-Т Последовательность Особая причина мутаций – транспозоны, их миграция может сопровождаться делециями

Индуцированные мутации Возникают под действием мутагенов Мутагены: а) физические (УФ-облучение) б) химические (аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований) в) биологические (транспозоны, IS-элементы, плазмиды) Проявляются в фенотипе в виде утраты/изменения морфологических и биохимических признаков (жгутики, капсула, синтез некоторых аминокислот и др. ).

R-S- диссоциация Появление в чистой культуре, образующей S-формы колоний, R - форм колоний как внешнее проявление изменений свойств образующих их бактериальных клеток Механизм: Инсертационная мутация, приводящая к утрате генов, контролирующих синтез полисахаридных звеньев ЛПС наружной мембраны клеточной стенки Биологическое значение: R -формы более устойчивы к физико-химическим факторам внешней среды S-формы более устойчивы к фагоцитозу и действию антител Значительно усложняют выделение и идентификацию чистой культуры

Генетические рекомбинации Это изменчивость, происходящая в результате включения ДНК реципиентной клетки участка ДНК клетки-донора 1. Трансформация – поглощение свободной ДНК из внешней среды. 2. Конъюгация – внедрение ДНК из бактериальной клетки – донора в клетку реципиента. 3. Трансдукция – распространение генов бактерий умеренными бактериофагами.

Трансформация ØПеренос части генома донора в клетку реципиента без их непосредственного контакта Особенность: ØИсточником ДНК может быть любая убитая культура м/о, но включаться в геном способна только гомологичная ДНК, поэтому чаще встречается внутривидовая трансформация

Этапы трансформации: 1. Адсорбция ДНК-донора на клетке- реципиенте. 2. Ферментативное расщепление ДНК донора на мелкие фрагменты. 3. Проникновение в клетку фрагмента ДНК. 4. Встраивание фрагмента в геном реципиента. 5. Экспрессия – интенсивное размножение трансформированных клеток.

Трансдукция ØПередача участка бактериальной ДНК посредством бактериофага В процессе репликации фага внутри бактерий, фрагмент бактериальной ДНК проникает в фаговую частицу и переносится вместе с ней в бактерию- реципиент

Трансдукция 1. Специфическая трансдукция (общая) Осуществляется перенос любого фрагмента ДНК вирулентным бактериофагом 2. Специфическая трансдукция (частная) Осуществляется перенос определенного фрагмента ДНК умеренным бактериофагом 3. Абортивная трансдукция Фрагмент ДНК-донора не встраивается в хромосому реципиента, а остается в цитоплазме (в конечном счете утрачивается в потомстве)

Неспецифическая

Специфическая

Стадии трансдукции Донор Реципиент Трансдуктант

Конъюгация ØПеренос части генетического материала путем прямого контакта между двумя клетками Необходимым условием конъюгации является наличие в клетке-доноре трансмиссивной плазмиды или F-плазмиды

Трансмиссивные плазмиды кодируют половые пили, образующие конъюгационный мостик между клеткой- донором и клеткой-реципиентом

Этапы конъюгации: 1. Прикрепление конца половой ворсинки к реципиентной клетке 2. Образование между клетками цитоплазматического мостика 3. Передача плазмид, находящихся в автономном состоянии (F-, R-, Col-, Tox- и другие)

Стадии конъюгации 1. Образование и стабилизация межклеточного контакта 2. Сайт-специфическое разрезание в точке начала переноса (ori. T) одной из цепей молекулы ДНК, предназначенной для переноса 3. Раскручивание ДНК и перенос разрезанной цепи с 5 - конца в клетку-реципиент с одновременным замещающим синтезом ДНК в донорной клетке посредством механизма «катящегося колеса» 4. Рециркуляризация перенесенной ДНК 5. Синтез комплементарной цепи в клетке-реципиенте и восстановление. Формирование межклеточного сверхспирализации плазмидной ДНК 6. Расхождение клеток при конъюгации у E. coli контакта

Если F-плазмида находится в клетке в интегрированном состоянии, то при конъюгации она не передается, но определяет точку разрыва хромосомы и тот её участок, который переходит в реципиентную клетку

Конъюгация при свободной F-плазмиде

Конъюгация при интегрированной F- плазмиде

Стадии конъюгации Конъюгация с F+ Включение А ВС В А ВС А С Обработка Выключение акридиновым оранжевым Клетка F- Клетка F+ Клетка Hfr Конъюгация Включение В А С Реципиент Донор Клетка F

Прикладные аспекты генетики бактерий ДИАГНОСТИКА ЛЕЧЕНИЕ ПРОФИЛАКТИКА Обнаружение Преодоление Создание атипичных форм антибиотико- искусственных возбудителя резистентности вакцин (L-формы и др. ) Генетические методы: Создание ДНК-гибридизация, ПЦР и др. Генно- эубиотиков Генные инженерные Геносистематика ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Благодарю за внимание