Фундаментальные и прикладные проблемы хронических инфекций Академик РАМН

Фундаментальные и прикладные проблемы хронических инфекций Академик РАМН А. Л. Гинцбург IX Съезд Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации» 26 -27 апреля 2007 г. Москва

В основе многих хронических патологических процессов лежит воспаление, индуцируемое инфекционными агентами Обструктивные легочные заболевания Сердечно-сосудистые заболевания Онкологические заболевания Гастрит, язва желудка Хр. заболевания печени Артриты Пусковым механизмом развития хронических патологий является инфицирование конкретными микроорганизмами

Статистика смертности по всему миру на 2002 г. (по данным ВОЗ) Количество смертельных случаев % смертельных случаев Всего на 6 224 985 тыс. населения 57 029 тыс. Инфекционные болезни 18 324 тыс. 32, 1% Соматические заболевания из них хронические заболевания 33 537 тыс. 58, 8% 70% 22 346 тыс. 39, 2%

Хронические патологии различных систем организма, в основе которых лежит воспалительный процесс, индуцированный бактериальными и вирусными инфекциями Нозологическая единица Этиологический агент Атеросклероз C. pneumoniae Эндокардит Streptococcus sp. , Enterococcus sp Туберкулез Mycobacterium tuberculosis Хронический обструктивный бронхит M. сatarrhalis St. pneumoniae H. influenzae Хронический бруцеллез Brucella sp. Сифилис T. pallidum Рак простаты Mycoplasma hominis Лимфома H. pilori Хронические уретриты и простатиты N. meningitides, N. gonorrhoae, T. pallidum, Mycoplasma sp. , U. urealyticum, Chlamydia sp. , Str. pneumoniae, Enterococcus sp. Бесплодие, патология беременности, неонатальные инфекции Enterobacteriaceae, Campylobacteriaceae Артрит Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus sp. , Chlamydia sp. , Mycoplasma sp. , Borrelia sp. Хронический гепатит Гепатит С Цирроз печени Гепатит С Карцинома печени Гепатит С Астма бронхиальная Vycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae

Острая и хроническая инфекции – две разные формы взаимодействия патогена с организмом хозяина Антимикробный препарат изменчивость «Молекулярный Паразитизм» Размножение Выживание Распространение Острая инфекция Хроническая инфекция

Первой линией борьбы с инфекционными агентами служит врожденный иммунитет, основу которого составляют различные фагоцитирующие клетки, на поверхности которых располагаются различного класса рецепторы Toll-4 Toll-2 My. D 88 NFk. B фагосома IFN-γ TNF-α Ядро IL-1 IL-2 IL-6 Транскрипционная активация генов провоспалительных цитокинов

Специфичность Толл-подобных рецепторов (TLRs) Бактериальные компоненты Липопротеины Липоарабидоманнан Липотейхоевые кислоты Зимозан (дрожжи) Вирусные компоненты T. gondi Профилин ЛПС Флагеллин Неметилированная Cp. G ДНК дц. РНК оц. РНК Неизвестные компоненты ? ? TLR 1 CD 14 TLR 6 TLR 2 TLR 4 TLR 5 TLR 11 TLR 9 TLR 3 TLR 7 TLR 8 TLR 10

Сигнальные пути Толл-подобных рецепторов (TLRs) TLR My. D 88 IRAK TRAF 6 NF-k. B Индукция экспрессии провоспалительных и антимикробных факторов

Благодаря взаимодействию с цитоскелетом, только Toll-содержащие фагосомы попадают в секреторную часть клетки – аппарат Гольджи TLR фагосома GP 1 лизососома МНС деградация

Иммуномодуляторы все по своей природе являются лигантами и индукторами для Toll-подобных рецепторов Группа Природа соединений Представители I Природные соединения (микроорганизмы и их компоненты) Бактериальные и вирусные вакцины, эндотоксины, липополисахариды, гликаны, продигиозан, сальмазан, пирогенал, рибомунил II Синтетические препараты (высоко и низкомолекулярные) Полифосфаты, поликарбоксилаты, полисульфаты, левамизол, инозиплес, диуцифон Это справедливо в отношении как иммуномодуляторов, являющимися фрагментами клеточной стенки грам(-) и грам(+) бактерий, получаемых из природных источников или химически синтезированных, иммуномодуляторов полинуклеатидной природы, полиэлектролитов как растительного происхождения, так и химически созданных.

Схема конструирования клеток, экспрессирующих Toll-подобный рецептор Лентивирусный вектор, несущий ген b-галактозидазы под контролем NF-k. B зависимого промотера лиганд Лентивирусный вектор, несущий ген Toll-подобного рецептора Toll-подобный рецептор Активация NF-k. B Экспрессия гена b-галактозидазы Экспрессия гена TLR

Cхема NF-k. B-зависимой экспрессии гена галактозидазы после взаимодействия лиганда с TLRs Таким образом, созданная нами система позволяет легко, по цветной реакции на β-галактозидазу определять специфичность действия иммуномодулятора по отношению к тому или иному Toll-рецептору, а следовательно и патогену, и в ряду гомологичных по специфичности иммуномодуляторов оценивать количественно их силу.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОЛЛ-ПОДОБНЫХ РЕЦЕПТОРОВ СПЕЦИФИЧНЫХ ДЛЯ ПИРОГЕНАЛА (1) И ФЛАГЕЛЛИНА (2) 1 активность -галактозидазы, ОD 420 293 h. TLR 4/CD 14 -MD 2 1, 8 1, 6 1, 4 1, 2 1 0, 8 0, 6 0, 4 0, 2 0 K- ЛПС, 50 нг/мл Пирогенал 250 нг/мл Пирогенал 10 нг/мл Пирогенал 50 нг/мл Пирогенал 10 нг/мл 2 активность -галактозидазы, ОD 420 293 h. TLR 5 1, 8 1, 6 1, 4 1, 2 1 0, 8 0, 6 0, 4 0, 2 0 K- Флагеллин, 10 нг/мл Пирогенал 250 нг/мл В настоящее время созданы клеточные линии для исследования иммуномодуляторов по отношению к Toll 4, 2, 6, 5, 7 и 9. При использовании разработанных систем скрининга была установлена специфичность действия различных иммуномодуляторов. Предлагается использование разработанных систем для скрининга химических библиотек с целью поиска новых, высокоэффективных иммуномодуляторов – химических лигандов Toll-подобных рецепторов.

Итак, мы пришли к заключению, что фагоцитоз является основополагающим моментом, определяющим характер взаимодействия патогена с макроорганизмом, за что И. И. Мечников 99 лет тому назад получил Нобелевскую премию. За это время мы узнали ряд ценных деталей, позволяющих уже сейчас управлять процессом фагоцитоза. Что же происходит с патогенами, которым удалось избежать фагоцитоза, каковы их шансы в отношении становления хронической инфекции?

Наиболее универсальной и эффективной системой, позволяющей Остаться на «свободе» , не быть фагоцитированной, является наличие у бактерии так называемой третьей транспортной системы. Цитоплазма Клеточная мембрана Внешняя мембрана Периплазма Внутренняя мембрана APTase (Inv. C) Inner membrane components (Inv. A, Spa. P, Spa. Q, Spa. R, Spa. S) Это кластер генов, примерно около 20. Эти гены включаются при контакте бактерии с наружной мембраной. Синтезирующиеся белки, образуют фактически молекулярный шприц, соединяющий цитоплазму бактериальной и эукариотической клеток. Через этот шприц бактерия вводит в клетку различные белки, в том числе и белки разрушающие цитоскелет, тем самым блокируя подвижность и образование псевдоподий у фагоцита.

По мере увеличения количества внеклеточных бактерий, начинают включаться молекулярные механизмы, определяющие социальное поведение бактериального сообщества Наиболее важным медицинским и эпидемиологическим аспектом которого является образование биопленок. Показано, что независимо от того, где персистируют бактерии, в организме хозяина или во внешней среде, бактерии образуют структуры называемые биопленками.

Перечень инфекционных заболеваний, ассоциированных с биопленками Инфекция или заболевание Бактерии-возбудители, способные к формированию биофильмов Кариес зубной Периодонтит Грамположительные кокки (Streptococcus spp) Грамположительные анаэробные бактерии ротовой полости Отиты Инфекции костно-мышечной системы Некротизирующие фасциты Инфекции билиарного тракта Остеомиелиты Бактериальные простатиты Эндокардиты Кистозно-фиброзная пневмония Мелиоидозы Внутрибольничные инфекции Пневмония, вызываемая различными возбудителями, в отделениях интенсивной терапии Инфекции хирургических швов Exit sites Артериовенозные шунты Склерит Нетипируемые штаммы Haemophilus influenzae Грампожительные кокки (staphylococci) Стафилококки группы А Кишечные бактерии (Escherichia coli) Различные виды бактерий и грибов – часто вместе E. coli и другие грамотрицательные бактерии Различные группы стрептококков Pseudomonas aeruginosa Burkholderia cepacia Pseudomonas pseudomallei Грамотрицательные палочки Staphyloccoccus epidermidis и S. aureus Грамположительные кокки Pseudomonas aeruginosa и грамположительные кокки E. coli и другие грамположительные rods Множество бактерий и грибы Actinimyces israelii, S. aureus, S. epidermidis, P. aeruginosa, Neisseria gonorreae, Candida albicans Множество бактерий и грибов Staphyloccoccus epidеrmidis и C. albicans Staphyloccoccus epidermidis и другие S. aureus и Staphyloccoccus epidermidis Грамположительные кокки Множество бактерий и грибов Staphyloccoccus epidermidis и S. aureus Контактные линзы Катетерные циститы мочеполовой системы Перитониальные диализные перитониты Инфекции, обусловленные внутриматочными противозачаточными спиралями Эндотрахеальные трубки Хикман-катетеры Центральные венозные катетеры Искусственные сосуды сердца Сосудистые имплантанты Билиарные эндопротезы Ортопедические протезы

Прямое электронно-микроскопическое исследование живой биопленки, состоящей из бактерий одного вида или сложного мультивидового сообщества показало, что в основном, структура биопленок универсальна и, независимо от состава, различается незначительно. Живая, полноценная биопленка состоит из клеток (15% объема), окруженных матриксом (85% объема), в виде различных образований, по форме напоминающих башни или грибы. Между микроколониями, состоящими из прикрепленных, «сидящих» клеток, проходят водные каналы и вода, циркулирующая по этим каналам образует конвекционный поток.

Чувствительность к антибиотикам свободно растущих и находящихся в составе биопленок патогенных бактерий Микроорганизм В жидкой среде Биопленка MIC mg/ml S. aureus Vancomycin 2 20 E. coli Ampicillin 2 512 P. pseudomallei Ceftazidime 8 800 Streptococcus Doxicycline 0, 063 3, 15 sanguis Структура биопленки и особенности физиологии составляющих ее клеток обеспечивают многократно повышенную, по сравнению с аналогичными свободно живущими бактериями, устойчивость членов сообщества к антимикробным препаратам, будь то антибиотики или факторы иммунной защиты макроорганизма. Механизмы этой устойчивости состоят в затруднении и замедлении проникновения антимикробных агентов через полисахаридный матрикс биопленки и замедлении скорости роста бактерий в биопленках. По мере достижения определенных размеров, часть клеток в виде биопленки отрывается, и она может фактически метастазировать в другие органы и ткани.

Биопленки не только обеспечивают защиту бактерий, но как показано в исследованиях, проведенных в лаборатории экологии возбудителей инфекционных заболеваний НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи, дает возможность активно обороняться от клеток, пытающихся фагоцитировать биопленку. На этих слайдах с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии исследовали взаимодействие вирулентного представителя Burkholderia cepacia с реснитчатым простейшим Tetrahymena pyriformis, одним из наиболее часто встречающихся простейших, способных к фагоцитозу. 7 h 7 h 7 18 h 18 h 36 h 36 h А. Наблюдается формирование биопленки в присутствии простейшего. В. Увеличенное изображение простейшего. Видны вакуоли, заполненные бактериями С и D. Разные стадии деструкции простейших. Простейшее лопнуло. Разрушен макронуклеос. Видна разрушающаяся вакуоль, ряд ьактерий вышел в цитоплазму. Таким образом, биопленка не только защищает бактерий от фагоцитоза обусловленного простейшими, но и уничтожает фагоцитирующую клетку. Конечная цель этих исследований изучить взаимодействие бактерий, находящихся в составе биопленок с фагоцитирующими клетками иммунной системы человека. Логика исследований состоит в идентификации бактериальных продуктов необходимых для защиты от фагоцитоза, что позволит блокировать образование биопленок или разрушать уже сформировавшиеся.

Безусловно важнейшим способом защиты от хронических инфекций, также как и от острых, является вакцинация. При этом, для успешного использования вакцин в борьбе с хроническими заболеваниями, необходимо понимать, что существующие вакцины, как правило, были созданы как профилактические препараты, а для борьбы с хроническими инфекциями они должны обладать терапевтическими свойствами. Очень наглядно эта проблема, как ее научная составляющая, так и организационная, видны при анализе эффективности вакцины BСG для различных групп населения. Вакцина BСG прекрасно защищает новорожденных, но ее протективный эффект против легочного туберкулеза взрослых (основной по частоте и эпидемиологической опасности форме) как правило низок. Изучение микобактерий методами клеточной микробиологии и биоинформатики позволили понять причины различной эффективности BСG.

Зрелая гранулема BCG – живая вакцина, и после введения вызывает инфекционный процесс, который у иммунологически полноценных переходит в стадию персистенции, при которой бактерии BCG становятся некультивируемыми 2 6 4 1 3 1 2 5 3 6 1 6 5 1 1 3 2 1 3 4 5 1 2 3 4 5 6 – – – BCG фибробласты эпителиоидные клетки моноциты макрофаги лимфоциты

Иммунодоминантные антигены, характерные для острой и хронической фаз туберкулезной инфекции Острая E s. AT-6 Хроническая N spx – 2 кристолин Ag 85 A фибронектин Ag 85 B связывающие Ag 85 C Продукты rpf-генов белки У НФ совершенно другая стратегия генома – экспрессируются другие гены, синтезируются другие белки (антигены). Так как протективный иммунитет при туберкулезе, как и при любой другой инфекции не стерильный, то со временем (7 -10 лет) в результате смены антигенного спектра антигены НФ не будут защищать от инфицирования возбудителями туберкулеза экспрессирующими антигены острой фазы.

Что же делать? Необходимо учитывать, что резкое снижение целенаправленных противотуберкулезных мероприятий, таких как санаторнокурортное лечение, специализированная белковая диета приводит к снижению эффективности врожденного иммунитета, что выражается в падении количества Tollподобных рецепторов, а как следствие этого фагоцитоза и эффективности полноценного иммунного ответа. В результате происходит увеличение прослойки чувствительных к туберкулезу людей.

Для эффективной вакцинопрофилактики туберкулеза Необходимо понимать какие задачи, профилактические или терапевтические, нужно решить. Профилактическая иммунизация Терапевтическая иммунизация Новорожденные BCG – Взрослые (–) BCG + поли. GC – Взрослые (+) – Вакцина на основе антигенов НФ С эпидемиологической точки зрения имеет смысл рассмотреть три ситуации. Если вакцинируются новорожденные с полноценным врожденным иммунитетом, то BСG в том виде в котором она существует полностью адекватна имеющимся задачам. Если вакцина применяется для взрослых положительных в туберкулиновой пробе, то необходимо применение еще несуществующей терапевтической вакцины. Если пациент отрицателен в туберкулиновой пробе, то необходимо использовать BСG в бустерном варианте, усиливающем врожденный иммунитет, а именно поли. Gp. C+BCG (для индикации рецептора TLR 3) или хитшоковые белки + BCG (для индикации Toll-4 рецептора). Эти варианты вакцины в данный момент созданы и испытываются. Таким образом, борясь с патогенном всегда нужно четко знать какую стратегию реализует наш соперник. И в зависимости от этого применять те или иные средства диагностики, профилактики и лечения, хотя при этом надо констатировать, что мы очень ограничены в выборе средств для противостояния патогенам, когда они вызывают хронические заболевания.