Скачать презентацию Формы мембранных структур встречающиеся в клетке Везикулы тубулы Скачать презентацию Формы мембранных структур встречающиеся в клетке Везикулы тубулы

Везикулярный транспорт lecture3-coats.ppt

  • Количество слайдов: 33

Формы мембранных структур, встречающиеся в клетке Везикулы тубулы, цистерны, (часто изогнутые) тубуло-везикулярные структуры Направления Формы мембранных структур, встречающиеся в клетке Везикулы тубулы, цистерны, (часто изогнутые) тубуло-везикулярные структуры Направления инвагинации мембраны Формирование транспортных пузырьков или тубул Формирование внутренних пузырьков МВТ, раффлов выход вирусных частиц

Все встречающиеся в клетке формы и их изменения можно получить экспериментально на модельных липидных Все встречающиеся в клетке формы и их изменения можно получить экспериментально на модельных липидных бислойных пузырьках (LUVs, large unilamellar vesicles) LUV Давление; осмос; Электрическое поле; Градиент р. Н p. H 1 p. H 2

 • изменения формы мембраны определяются их физикохимическими свойствами • Формирование транспортных везикул может • изменения формы мембраны определяются их физикохимическими свойствами • Формирование транспортных везикул может происходить и без участия белков Но: Белковые окаймления определяют место и время формирования пузырька, селективный выбор груза и точки конечного назначения (мишень)

Окаймления (coats) • COPI и COPII –окаймления • “клатриновые” окаймления: АР 1, АР 2, Окаймления (coats) • COPI и COPII –окаймления • “клатриновые” окаймления: АР 1, АР 2, АР 3, АР 4 GGA 1, GGA 2, GGA 3 ? ? ?

COP (Coat Proteins)-окаймления обслуживают биосинтетический путь: COPI: intra. Golgi , Golgi > ER COPII: COP (Coat Proteins)-окаймления обслуживают биосинтетический путь: COPI: intra. Golgi , Golgi > ER COPII: ER > Golgi (ERGIC ? )

COPI: Минимальная система in vitro: ARF 1* + коутомер (coatomer) + липосома (из кислых COPI: Минимальная система in vitro: ARF 1* + коутомер (coatomer) + липосома (из кислых липидов) коутомер ARF 1 (ADF-ribosylation factor 1) - малая ГТФаза, Миристилирована (несет остаток миристиловой кислоты) ARF 1 -GDP – в цитозоле; ARF 1 -GTP (ARF 1*) – ассоциирована с мембраной

Фосфатидилхолин ARF 1 cyt GEF ARF 1* PLD фосфатидная к-та ( - ) Холин Фосфатидилхолин ARF 1 cyt GEF ARF 1* PLD фосфатидная к-та ( - ) Холин Golgi c Регуляторы нацеливания и слияния ARF 1* a c F 1* a AR r r g o AR F 1* o коутомер g c a r ARF 1 o o r F 1 AR c a r ARF 1 g o * o g r a c * AR F 1 c a * r g o * g g c c a r g o r a ARF 1 a * AR F 1 r g o c a r g o c

Грузы селектируются за счет взаимодействия со своими мембранными рецепторами, узнающими определенные последовательности в молекулах Грузы селектируются за счет взаимодействия со своими мембранными рецепторами, узнающими определенные последовательности в молекулах грузов (напр. , KDEL, KKXX etc. ) На роль мембранных рецепторов претендуют белки семейства р24: ARF 1*

В жизненном цикле COPI-везикулы присутствуют 2 GAP-активности Медленная – циклы гидролиза ГТФ на ARF В жизненном цикле COPI-везикулы присутствуют 2 GAP-активности Медленная – циклы гидролиза ГТФ на ARF 1 под ее действием необходимы для накопления груза; Она создает временное окно, в течение которого пузырек заполняется грузом Быстрая - после полной сборки окаймления следует быстрый гидролиз ГТФ на ARF 1, отделение пузырька и разборка окаймления; коутомер не является ARFGAP, тем не менее его ассоциация с везикулой значительно ускоряет гидролиз ГТФ.

COPI на других органеллах COPI на эндосомах: 1. Нет - и -субъединиц 2. -COP COPI на других органеллах COPI на эндосомах: 1. Нет - и -субъединиц 2. -COP посттрансляционно модифицирован (фосфорилирован? ) 3. COPI на эндосомах мало по сравнению с мембранами АГ 4. Дефекты по -COP препятствуют образованию мультивезикулярных тел 5. Ассоциация с мембраной зависит от Rab-белков , а не ARF 1 ARF 6 -GTP - локализован на ПМ ARF 6 -GDP – локализован на рециклирующих эндосомах ARF 6 взаимодействует с Rac 1 и участвует в реорганизации кортикального актинового цитоскелета

COPII : ER > G (ERGIC) минимальная система in vitro: • Sar 1 p COPII : ER > G (ERGIC) минимальная система in vitro: • Sar 1 p - инициирующая малая ГТФаза; • два белковых комплекса: р13/р31 и р23/р24 р13/p 31 СOPII-везикулы разной степени фиксации p 23/p 24

Sar 1 p. GAP Emp 24 pсемейство Sar 1 p GEF Sar 1 p. GAP Emp 24 pсемейство Sar 1 p GEF

После добавления к р23/р24 -комплексу комплекса р13/р31 происходит их стабилизация (полимеризация) и искривление мембраны. После добавления к р23/р24 -комплексу комплекса р13/р31 происходит их стабилизация (полимеризация) и искривление мембраны. Таким образом, в случае COPII-окаймления движущей силой искривления является изменение конформации белков.

 «Клатриновые» окаймления (Clathrin coats) 1. АР (adaptor proteins) -1, -2, -3, -4 2. «Клатриновые» окаймления (Clathrin coats) 1. АР (adaptor proteins) -1, -2, -3, -4 2. GGA (Golgi-localized adaptor, -ear containing, ARFbinding protein) 1, 2, 3 3. HRS/SNX? HRS/ SNX 1

AP-комплексы состоят из адаптинов (adaptins) Клатриновые окаймления Ear Hinge head Другие вспомогательные белки Клатрин AP-комплексы состоят из адаптинов (adaptins) Клатриновые окаймления Ear Hinge head Другие вспомогательные белки Клатрин Карго карго локализация GGA – гомологичны -адаптину

Структура клатринового олигомера (трискелиона) и модель сборки плоской клатриновой решетки Клатрин при определенных условиях Структура клатринового олигомера (трискелиона) и модель сборки плоской клатриновой решетки Клатрин при определенных условиях (р. Н 6. 7, Mg 2+) обладает способностью к самосборке video

Плоские решетки, повсей видимости, играют роль сортирующих платформ в эндосомах и ассоциируются с мембраной Плоские решетки, повсей видимости, играют роль сортирующих платформ в эндосомах и ассоциируются с мембраной через HRS/SNX Cемейство SNX (sorting nexins) сод. около 30 членов, способны взаимодействовать с клатрином и с определенными рецепторами HRS –взаимодействует с клатрином и с PI 3 фосфатом на мембране, узнает ТК рецепторы Окаймленные ямки

Сборка GGA- и AP 1 -зависимых окаймлений (на мембранах транс. Гольджи и эндосом) 1. Сборка GGA- и AP 1 -зависимых окаймлений (на мембранах транс. Гольджи и эндосом) 1. Инициирующая ГТФаза ARF 1 (GTP) рекрутирует GGA или АР 1 2. ARF 1 -GGA рекрутирует рецептор к маннозо-6 -фосфату (MPR), что создает условия для сборки клатринового окаймления TGN > late endosomes cytosol MP Поздние эндосомы R AP 1 Clathrin AP 1 M P R late endosomes > TGN Clathrin

AP 3 - гомологичен другим АР-окаймлениям, но работает без клатрина Осуществляет непосредственный транспорт лизосомных AP 3 - гомологичен другим АР-окаймлениям, но работает без клатрина Осуществляет непосредственный транспорт лизосомных белков из TGN в вакуоль (лизосомы). Эндосомы? 1. ARF 1 инициирует сборку 2. Нуклеация – казеин-киназа 1 (csk 1) фосфорилирует 3 субъединицу АР 3 3. Сборка окаймления, рекрутирование груза ARF 1* GEF AP 3 ARF 1 csk 1 AP 3

AP-2 окаймление работает на ПМ, с его помощью идет рецептор-опосредованный эндоцитоз Наиболее сложно организовано: AP-2 окаймление работает на ПМ, с его помощью идет рецептор-опосредованный эндоцитоз Наиболее сложно организовано: через него осуществляется контакт клетки с внешней средой под ПМ имеется слой кортикального актина, затрудняющий инвагинирование мембраны 1. Основные компоненты: АР 2+клатрин 2. Неизвестна инициирующая малая ГТФаза 3. Несколько способов селектирования груза (поскольку груз весьма разнообразен)

Как инициируется сборка АР-2 окаймления? 1. Сборку инициируют рецепторы-грузы 2. Но: в одни и Как инициируется сборка АР-2 окаймления? 1. Сборку инициируют рецепторы-грузы 2. Но: в одни и те же ямки могут попадать рецепторы различной природы (метаболические и сигнальные) 2. Сборка идет конститутивно Фибробласты : 2 -3 тыс ОЯ/мин Оказалось, что на мембране существуют области, «разрешенные» для формирования окаймленных ямок, именно в пределах такой области и может инициироваться сборка новых окаймлений Большую роль в стабилизации «зон эндоцитоза» играет актиновый цитоскелет На роль инициаторов претендуют PI(4, 5) P 2 и синаптотагмин

На начальном этапе формирования ОЯ работают белки, определяющие границу будущей инвагинации Синаптотагмин (PI(4, 5)P На начальном этапе формирования ОЯ работают белки, определяющие границу будущей инвагинации Синаптотагмин (PI(4, 5)P 2) epsin AP 180 endophilin AP 180 имеет самое высокое сродство к клатрину Endophilin – LPA-ацилтрансфераза добавляет к LPA остаток арахидоновой кислоты, у которой менее упорядоченная структура и больший диаметр > искривление мембраны Eps 15/epsin – участвуют в сортировке груза, определении границ ОЯ и связи с кортикальным актином. В митозе фосфорилированы, что блокирует эндоцитоз Eps 15/

Механизмы сортировки рецепторов в окаймленные ямки 1. АР 2 узнает сигнальную последовательность в цитоплазматическом Механизмы сортировки рецепторов в окаймленные ямки 1. АР 2 узнает сигнальную последовательность в цитоплазматическом домене рецептора ( в основном метаболические рецепторы, которые постоянно локализуются в ОЯ) 2. Сигнальные последовательности играют меньшую роль, заякоривание в ОЯ происходит через взаимодействие с сопутствующими белками (accesory proteins) Eps 15/epsin. Существенно убиквитинирование груза. Этот механизм характерен для рецепторов, попадающих в ОЯ только в результате стимуляции (рецептор ЭФР) 3. GPCR (G-protein coupled receptors) – связываются с АР 2 через аррестин 2 3 1 AP 2 L L AP 2 Y AP 2 arrestin

Формирование окаймленной ямки (ОЯ) GDP Hsc 70 auxillin dynamin amphiphysin GTP Формирование окаймленной ямки (ОЯ) GDP Hsc 70 auxillin dynamin amphiphysin GTP

Dynamin –атипичная ГТФаза (100 к. Да) Обладает высокой скоростью гидролиза ГТФ Поскольку концентрация ГТФ Dynamin –атипичная ГТФаза (100 к. Да) Обладает высокой скоростью гидролиза ГТФ Поскольку концентрация ГТФ в клетке очень высока (1 m. M), то динамин д. бы в основном находиться в ГТФ-св. форме. Но это не так , поскольку осуществляется регуляция обмена нуклеотидов на динамине. GED-домен – это внутренний GEF, активирующийся при полимеризации (выстраивании молекул динамина в спираль) Динамин способен взаимодействовать с множеством белков

Цепочки динамина способны формировать спирали вокруг липидных (и белковых) тубул, шаг спирали зависит от Цепочки динамина способны формировать спирали вокруг липидных (и белковых) тубул, шаг спирали зависит от связанного нуклеотида GTP S GDP

Существует несколько изоформ динамина (Dyn 1, 2, 3), Dyn 1 /2 участвуют в работе Существует несколько изоформ динамина (Dyn 1, 2, 3), Dyn 1 /2 участвуют в работе окаймлений (клатриновых и кавеолиноых), Dyn 3 «занимается» тубуляцией (Т-система скелетных мышц)

Формирование и разборка АР-2 окаймления – процесс, в ходе которого взаимодействия разных элементов ОЯ Формирование и разборка АР-2 окаймления – процесс, в ходе которого взаимодействия разных элементов ОЯ друг с другом происходят в строгой очередности Как идет его «оркестровка» ?

По-видимому, большинство белков в клетках выполняют более чем одну функцию (уже известную нам), другая По-видимому, большинство белков в клетках выполняют более чем одну функцию (уже известную нам), другая (или другие) может оказаться весьма неожиданной Nucleocytoplasmic Shuttling of Endocytic Proteins M. Vecchi, S. Polo, V. Poupon, J. -W. van de Loo, A. Benmerah, P. P. Di Fiore* The Journal of Cell Biology, Volume 153, Number 7, June 25, 2001 1511– 1517 Evidence that dynamin-2 functions as signal-transducing GTPase. Fish KN, Schmid SL, Damke H: J Cell Biol 2000, 150: 145 -154. Eps 15, epsin , -adaptin накапливаются в ядре, если блокирован ядерный экспорт. Ядерный пул этих белков никак не участвует в эндоцитозе Динамин участвует в сигналинге: он способен активировать транскрипционный фактор р53, стимулируя апоптоз The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis. Frank S, Gaume B, Bergmann-Leitner ES, Leitner WW, Robert EG, • Catez F, Smith CL, Youle RJ: Dev Cell 2001, 4: 515 -525.