Формы мембранных структур встречающиеся в клетке Везикулы тубулы

Формы мембранных структур, встречающиеся в клетке Везикулы тубулы, цистерны, (часто изогнутые) тубуло-везикулярные структуры Направления инвагинации мембраны Формирование транспортных пузырьков или тубул Формирование внутренних пузырьков МВТ, раффлов выход вирусных частиц

Все встречающиеся в клетке формы и их изменения можно получить экспериментально на модельных липидных бислойных пузырьках (LUVs, large unilamellar vesicles) LUV Давление; осмос; Электрическое поле; Градиент р. Н p. H 1 p. H 2

• изменения формы мембраны определяются их физикохимическими свойствами • Формирование транспортных везикул может происходить и без участия белков Но: Белковые окаймления определяют место и время формирования пузырька, селективный выбор груза и точки конечного назначения (мишень)

Окаймления (coats) • COPI и COPII –окаймления • “клатриновые” окаймления: АР 1, АР 2, АР 3, АР 4 GGA 1, GGA 2, GGA 3 ? ? ?

COP (Coat Proteins)-окаймления обслуживают биосинтетический путь: COPI: intra. Golgi , Golgi > ER COPII: ER > Golgi (ERGIC ? )

COPI: Минимальная система in vitro: ARF 1* + коутомер (coatomer) + липосома (из кислых липидов) коутомер ARF 1 (ADF-ribosylation factor 1) - малая ГТФаза, Миристилирована (несет остаток миристиловой кислоты) ARF 1 -GDP – в цитозоле; ARF 1 -GTP (ARF 1*) – ассоциирована с мембраной

Фосфатидилхолин ARF 1 cyt GEF ARF 1* PLD фосфатидная к-та ( - ) Холин Golgi c Регуляторы нацеливания и слияния ARF 1* a c F 1* a AR r r g o AR F 1* o коутомер g c a r ARF 1 o o r F 1 AR c a r ARF 1 g o * o g r a c * AR F 1 c a * r g o * g g c c a r g o r a ARF 1 a * AR F 1 r g o c a r g o c

Грузы селектируются за счет взаимодействия со своими мембранными рецепторами, узнающими определенные последовательности в молекулах грузов (напр. , KDEL, KKXX etc. ) На роль мембранных рецепторов претендуют белки семейства р24: ARF 1*

В жизненном цикле COPI-везикулы присутствуют 2 GAP-активности Медленная – циклы гидролиза ГТФ на ARF 1 под ее действием необходимы для накопления груза; Она создает временное окно, в течение которого пузырек заполняется грузом Быстрая - после полной сборки окаймления следует быстрый гидролиз ГТФ на ARF 1, отделение пузырька и разборка окаймления; коутомер не является ARFGAP, тем не менее его ассоциация с везикулой значительно ускоряет гидролиз ГТФ.

COPI на других органеллах COPI на эндосомах: 1. Нет - и -субъединиц 2. -COP посттрансляционно модифицирован (фосфорилирован? ) 3. COPI на эндосомах мало по сравнению с мембранами АГ 4. Дефекты по -COP препятствуют образованию мультивезикулярных тел 5. Ассоциация с мембраной зависит от Rab-белков , а не ARF 1 ARF 6 -GTP - локализован на ПМ ARF 6 -GDP – локализован на рециклирующих эндосомах ARF 6 взаимодействует с Rac 1 и участвует в реорганизации кортикального актинового цитоскелета

COPII : ER > G (ERGIC) минимальная система in vitro: • Sar 1 p - инициирующая малая ГТФаза; • два белковых комплекса: р13/р31 и р23/р24 р13/p 31 СOPII-везикулы разной степени фиксации p 23/p 24

Sar 1 p. GAP Emp 24 pсемейство Sar 1 p GEF

После добавления к р23/р24 -комплексу комплекса р13/р31 происходит их стабилизация (полимеризация) и искривление мембраны. Таким образом, в случае COPII-окаймления движущей силой искривления является изменение конформации белков.

«Клатриновые» окаймления (Clathrin coats) 1. АР (adaptor proteins) -1, -2, -3, -4 2. GGA (Golgi-localized adaptor, -ear containing, ARFbinding protein) 1, 2, 3 3. HRS/SNX? HRS/ SNX 1

AP-комплексы состоят из адаптинов (adaptins) Клатриновые окаймления Ear Hinge head Другие вспомогательные белки Клатрин Карго карго локализация GGA – гомологичны -адаптину

Структура клатринового олигомера (трискелиона) и модель сборки плоской клатриновой решетки Клатрин при определенных условиях (р. Н 6. 7, Mg 2+) обладает способностью к самосборке video

Плоские решетки, повсей видимости, играют роль сортирующих платформ в эндосомах и ассоциируются с мембраной через HRS/SNX Cемейство SNX (sorting nexins) сод. около 30 членов, способны взаимодействовать с клатрином и с определенными рецепторами HRS –взаимодействует с клатрином и с PI 3 фосфатом на мембране, узнает ТК рецепторы Окаймленные ямки

Сборка GGA- и AP 1 -зависимых окаймлений (на мембранах транс. Гольджи и эндосом) 1. Инициирующая ГТФаза ARF 1 (GTP) рекрутирует GGA или АР 1 2. ARF 1 -GGA рекрутирует рецептор к маннозо-6 -фосфату (MPR), что создает условия для сборки клатринового окаймления TGN > late endosomes cytosol MP Поздние эндосомы R AP 1 Clathrin AP 1 M P R late endosomes > TGN Clathrin

AP 3 - гомологичен другим АР-окаймлениям, но работает без клатрина Осуществляет непосредственный транспорт лизосомных белков из TGN в вакуоль (лизосомы). Эндосомы? 1. ARF 1 инициирует сборку 2. Нуклеация – казеин-киназа 1 (csk 1) фосфорилирует 3 субъединицу АР 3 3. Сборка окаймления, рекрутирование груза ARF 1* GEF AP 3 ARF 1 csk 1 AP 3

AP-2 окаймление работает на ПМ, с его помощью идет рецептор-опосредованный эндоцитоз Наиболее сложно организовано: через него осуществляется контакт клетки с внешней средой под ПМ имеется слой кортикального актина, затрудняющий инвагинирование мембраны 1. Основные компоненты: АР 2+клатрин 2. Неизвестна инициирующая малая ГТФаза 3. Несколько способов селектирования груза (поскольку груз весьма разнообразен)

Как инициируется сборка АР-2 окаймления? 1. Сборку инициируют рецепторы-грузы 2. Но: в одни и те же ямки могут попадать рецепторы различной природы (метаболические и сигнальные) 2. Сборка идет конститутивно Фибробласты : 2 -3 тыс ОЯ/мин Оказалось, что на мембране существуют области, «разрешенные» для формирования окаймленных ямок, именно в пределах такой области и может инициироваться сборка новых окаймлений Большую роль в стабилизации «зон эндоцитоза» играет актиновый цитоскелет На роль инициаторов претендуют PI(4, 5) P 2 и синаптотагмин

На начальном этапе формирования ОЯ работают белки, определяющие границу будущей инвагинации Синаптотагмин (PI(4, 5)P 2) epsin AP 180 endophilin AP 180 имеет самое высокое сродство к клатрину Endophilin – LPA-ацилтрансфераза добавляет к LPA остаток арахидоновой кислоты, у которой менее упорядоченная структура и больший диаметр > искривление мембраны Eps 15/epsin – участвуют в сортировке груза, определении границ ОЯ и связи с кортикальным актином. В митозе фосфорилированы, что блокирует эндоцитоз Eps 15/

Механизмы сортировки рецепторов в окаймленные ямки 1. АР 2 узнает сигнальную последовательность в цитоплазматическом домене рецептора ( в основном метаболические рецепторы, которые постоянно локализуются в ОЯ) 2. Сигнальные последовательности играют меньшую роль, заякоривание в ОЯ происходит через взаимодействие с сопутствующими белками (accesory proteins) Eps 15/epsin. Существенно убиквитинирование груза. Этот механизм характерен для рецепторов, попадающих в ОЯ только в результате стимуляции (рецептор ЭФР) 3. GPCR (G-protein coupled receptors) – связываются с АР 2 через аррестин 2 3 1 AP 2 L L AP 2 Y AP 2 arrestin

Формирование окаймленной ямки (ОЯ) GDP Hsc 70 auxillin dynamin amphiphysin GTP

Dynamin –атипичная ГТФаза (100 к. Да) Обладает высокой скоростью гидролиза ГТФ Поскольку концентрация ГТФ в клетке очень высока (1 m. M), то динамин д. бы в основном находиться в ГТФ-св. форме. Но это не так , поскольку осуществляется регуляция обмена нуклеотидов на динамине. GED-домен – это внутренний GEF, активирующийся при полимеризации (выстраивании молекул динамина в спираль) Динамин способен взаимодействовать с множеством белков

Цепочки динамина способны формировать спирали вокруг липидных (и белковых) тубул, шаг спирали зависит от связанного нуклеотида GTP S GDP

Существует несколько изоформ динамина (Dyn 1, 2, 3), Dyn 1 /2 участвуют в работе окаймлений (клатриновых и кавеолиноых), Dyn 3 «занимается» тубуляцией (Т-система скелетных мышц)

Формирование и разборка АР-2 окаймления – процесс, в ходе которого взаимодействия разных элементов ОЯ друг с другом происходят в строгой очередности Как идет его «оркестровка» ?

По-видимому, большинство белков в клетках выполняют более чем одну функцию (уже известную нам), другая (или другие) может оказаться весьма неожиданной Nucleocytoplasmic Shuttling of Endocytic Proteins M. Vecchi, S. Polo, V. Poupon, J. -W. van de Loo, A. Benmerah, P. P. Di Fiore* The Journal of Cell Biology, Volume 153, Number 7, June 25, 2001 1511– 1517 Evidence that dynamin-2 functions as signal-transducing GTPase. Fish KN, Schmid SL, Damke H: J Cell Biol 2000, 150: 145 -154. Eps 15, epsin , -adaptin накапливаются в ядре, если блокирован ядерный экспорт. Ядерный пул этих белков никак не участвует в эндоцитозе Динамин участвует в сигналинге: он способен активировать транскрипционный фактор р53, стимулируя апоптоз The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis. Frank S, Gaume B, Bergmann-Leitner ES, Leitner WW, Robert EG, • Catez F, Smith CL, Youle RJ: Dev Cell 2001, 4: 515 -525.