ФИЗИОЛОГИЯ ПРОКАРИОТ Классификация бактерий по источнику углерода Автотрофы

ФИЗИОЛОГИЯ ПРОКАРИОТ

Классификация бактерий по источнику углерода Автотрофы (лат. autos – сам, trophe – питание) - синтезируют все углеродсодержащие компоненты клетки из СО2 Гетеротрофы (лат. heteros – другой) - используют готовые органические углеродсодержащие соединения: гексозы (глюкоза), многоатомные спирты, углеводороды, органические кислоты, аминокислоты и др.: из окружающей среды – сапрофиты живой клетки – паразиты: облигатные = только живой клетки: риккетсии хламидии факультативные = наряду с органическими соединениями окружающей среды – (большинствово патогенных бактерий)

Классификация бактерий по источнику энергии Фототрофы (фотосинтезирующие) - используют солнечную энергию, например: зеленые или пурпурные бактерии Хемотрофы (хемосинтезирующие) - получают энергию за счет окислительно-восстановительных реакций, например: серобактерии, железобактерии, нитрифицирующие бактерии и др.

Классификация бактерий по природе донора электронов Литотрофы (греч. litos – камень) - хемотрофные организмы, которые используют неорганические соединения: Н2, H2S, СН3 и др. Органотрофы - хемотрофные организмы, которые используют органические соединения: сахара, оксикислоты, многоатомные спирты

Классификация бактерий по источнику азота Прототрофы - усваивают азот из атмосферы, солей аммония, нитратов, нитритов, глюкозы; способны сами синтезировать все компоненты клетки Ауксотрофы - усваивают готовые азотсодержащие вещества из окружающей среды или организма хозяина; -теряют способность к синтезу какого-либо в-ва и требуют его наличия в среде культивирования В-во наз-ся фактор роста

Факторы роста бактерий

Пути проникновения питательных веществ в бактериальную клетку Без затраты энергии (диффузия) простая облегченная С затратой энергии активный транспорт = без химической модификации переносимых молекул транслокация химических групп = с химической модификацией переносимых молекул п е р м е а з ы

Дыхание бактерий или энергетический обмен веществ = цепь последовательных окислительно-восстановительных реакций, сопровождающихся переносом электронов от окисляющей системы к восстанавливающей и катализируемых строго специфичными ферментными системами.

Классификация бактерий по типу дыхания 1. Облигатные аэробы 2. Облигатные анаэробы 3. Факультативные анаэробы Среди них выделяют: А) Микроаэрофилы Б) Капнеические

Облигатные аэробы Не развиваются без доступа кислорода, Используют энергию, освобождающуюся при реакциях окисления, протекающих с поглощением свободного молекулярного кислорода. Растут на поверхности питательных сред. Например: холерный вибрион, возбудители сибирской язвы и туберкулеза

Облигатные анаэробы Кислород для них – яд! Они осуществляют ферментативное расщепление углеводов в анаэробных условиях – брожение. Растут на дне или в толще плотной питательной среды. Например: клостридии столбняка, ботулизма, газовой анаэробной инфекции

Факультативные анаэробы растут как при доступе кислорода, так и при его отсутствии. Используют энергию как от окислительных реакций, так и от брожения. Например: эшерихии, сальмонеллы, стафилококки Среди них выделяют: А) Микроаэрофилы - хорошо растут при пониженном содержании кислорода. Например: молочнокислые бактерии Б) Капнеические - требуют повышенной концентрации СО2. Например: бычий тип бруцелл, бифидумбактерии

Особенности метаболизма риккетсий, хламидий, микоплазм Риккетсии Не способны синтезировать некоторые макромолекулы → облигатный внутриклеточный паразитизм Хламидии Не способны синтезировать некоторые макромолекулы → облигатный внутриклеточный паразитизм Не способны синтезировать АТФ – «энергетические паразиты» Микоплазмы Не способны синтезировать стерины для ЦПМ – «мембранные паразиты»

Ферменты микроорганизмов белки, участвующие в метаболизме бактерий, распознают соответствующие им метаболиты, вступают с ними во взаимодействие и ускоряют течение химических реакций

Классификация бактериальных ферментов по механизму действия 1. Оксидоредуктазы (оксидазы, пероксидазы, каталазы, дегидрогеназы) – окислительно-восстановительные ферменты 2. Трансферазы – переносят отдельные радикалы и атомы от одних соединений к другим 3. Гидролазы (эстеразы, фосфатазы, глюкозидазы) – ускоряют реакции гидролиза = расщепление веществ на более простые с присоединением молекулы воды

Классификация бактериальных ферментов по механизму действия 4. Лиазы (карбоксилазы) – отщепляют от субстратов химические группы негидролитическим путем 5. Изомеразы (фосфогексоизомераза) – превращают органические соединения в их изомеры 6. Лигазы = синтетазы (аспарагинсинтетаза, глутаминсинтетаза) – ускоряют синтез сложных соединений из простых

Классификация бактериальных ферментов Экзоферменты Синтезируются во внешнюю среду Эндоферменты Локализация: Периплазматическое пространство ЦПМ Цитоплазма

Классификация бактериальных ферментов Конститутивные Синтезируются постоянно (в том числе и при отсутствии субстрата) Индуцибельные Синтезируются только при наличии субстрата Например: пенициллиназа – синтезируется только при наличии пенициллина

Классификация бактериальных ферментов Ферменты вирулентности (патогенности) – разрушают ткань и клетки, обусловливая распространение бактерий и их токсинов в инфицированной ткани: коллагеназа, ДНКаза, нейраминидаза, лецитиназа

РОСТ И РАЗМНОЖЕНИЕ БАКТЕРИЙ

Рост – координированное воспроизведение всех клеточных компонентов и структур, ведущее к увеличению массы клетки, - согласованное увеличение количества всех компонентов клетки. Размножение – увеличение числа клеток в популяции

Способы размножения бактерий Бинарное деление Большинство бактерий: перегородка формируется от КС к центру клетки – Г+ перетяжка клетки (клетка истончается посередине) – Г– Почкование Francisella Микоплазмы дрожжи Фрагментация нитевидных форм Актиномицеты Микоплазмы Экзоспоры Стрептомицеты Особый цикл деления Хламидии

Цикл развития хламидий

Стадии развития бактериальной популяции в жидкой питательной среде

Стадии роста периодической бактериальной культуры Лаг-фаза Деления клеток не происходит

Стадии роста периодической бактериальной культуры Положительного ускорения Скорость деления клеток увеличивается

Стадии роста периодической бактериальной культуры Логарифмического роста (экспоненциальная) Скорость деления клеток максимальная

Стадии роста периодической бактериальной культуры Отрицательного ускорения Скорость деления клеток снижается

Стадии роста периодической бактериальной культуры Стационарная фаза максимума Количество живых клеток постоянно

Стадии роста периодической бактериальной культуры Ускоренной гибели Количество живых клеток начинает снижаться (убывает с увеличивающейся скоростью)

Стадии роста периодической бактериальной культуры Логарифмической гибели Количество живых клеток убывает с максимальной скоростью

Стадии роста периодической бактериальной культуры Уменьшения скорости гибели Количество живых клеток убывает с уменьшающейся скоростью

Стадии роста периодической бактериальной культуры Стационарная фаза минимума Количество живых клеток минимально

Характер роста бактерий на жидких питательных средах Диффузный рост = помутнение – большинство бактерий, плёнка – «коховские бактерии» , придонный или пристеночный рост – стрептококки, плёнка со спускающимися вниз «сталактитами» – Yersinia pestis

Характер роста бактерий на плотных питательных средах

Характер роста бактерий на плотных питательных средах S-форма колоний («гладкая») кокки Грамотрицательные палочки, кроме Yersinia pestis R-форма колоний («шероховатая») Грамположительные палочки, Yersinia pestis

Некультивируемые формы бактерий В неблагоприятных условиях (в межэпидемический или межэпизоотический периоды) неспорообразующие бактерии переходят в некультивируемое состояние: бактерии сохраняют метаболическую активность, но не способны к клеточному делению, - клетки уменьшаются в размерах, - приобретают сферическую форму, - меняют вязкость ЦПМ, - у них сохраняется транспорт электронов по дыхательной цепи, - невысокий уровень метаболической активности.

Некультивируемые формы бактерий Факторы: - температура, - концентрация солей, - уровень кислорода, - содержание питательных веществ, - метаболиты водорослей. При смене условий→ клетки приобретают способность к размножению и восстанавливают свои свойства.

ПРИНЦИПЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ

Культивирование микроорганизмов

Требования к условиям культивирования бактерий 1.Питательные потребности простые – растут на универсальных питательных средах сложные – растут на специальных питательных средах 2.Температура культивирования ≈ 37°С – мезофилы (бол-во патогенных бактерий) 6 – 20°С – психрофилы (возбудители чумы и лептоспироза), 50 – 60°С – термофилы (актиномицеты, спороносные бациллы).

Требования к условиям культивирования бактерий 3. Реакция среды (рН) кислая – ацидофилы (рН = 4,0-6,0) нейтральная – большинство патогенных бактерий щелочная – алкалифилы ( для холерного вибриона рН = 7,8-8,6) 4.Условия аэрации не принимают во внимание – факультативные анаэробы ↓ О2 – микроаэрофилы ↑ СО2 – капнофилы без доступа воздуха – анаэробы с обязательным доступом воздуха – облигатные аэробы

Требования к условиям культивирования бактерий 5. Длительность культивирования - зависит от времени генерации, - для большинства бактерий составляет 24-48 ч; некоторые растут дольше: - бактерии коклюша – 2-5 сут, - микробактерии туберкулеза – 3-4 нед. 6. Освещение - например, микобактерии.

Питательные среды А) должны содержать воду, т к все процессы осуществляются в воде Б) должны содержать органический источник углерода и энергии: - органические соединения: углеводы (Глюкоза!) аминокислоты, органические кислоты, липиды, - пептон- продукт неполного гидролиза белков, состоит из поли-, олиго- дипептидов,

Питательные среды В) должна содержать: - источники азота – пептон и соли аммония, - серы - сульфаты, - фосфора - фосфаты, - микроэлементы = ионы кальция, магния, магранца, железа – соли (фосфаты) Г) должна обладать буферными свойствами = фосфатный буфер или фосфатный буфер + карбонат кальция Д) должна быть изотонической – 0,87% хлорид натрия

Классификация искусственных питательных сред По происхождению: Естественные – натуральные продукты животного, растительного или микробного происхождения (молоко, сыворотка, кровь, картофель, морковь), Синтетические – химически чистые соединения в строго определенных концентрациях = минимальные среды (основа: минеральные соли и глюкоза), Полусинтетические – минимальные среды, к которым добавлен пептон и дрожжевой экстракт

Классификация искусственных питательных сред По сложности изготовления: Простые – выпускаются промышленностью в сухом виде; основу их составляют пептоны – продукты ферментативного или кислотного гидролиза белков животных и рыбы (питательный бульон, питательный агар), Сложные - готовятся на основе простых: добавляют 1% сахара, 10-20% сыворотки крови или 5-10% крови (кровяной агар, сахарно-сывороточный агар)

Классификация искусственных питательных сред По консистенции Жидкие – мясной или рыбный бульон на дистиллированной воде (Питательный бульон), Плотные – готовятся на основе жидких, добавляют 1,5% агар-агара (полисахарид, получ-й из морских водорослей), силикагеля или 10-15% желатины (Питательный агар) Полужидкие – готовят на основе жидких, но агар-агара или силикагеля добавляют 0,7%, а желатины – 5-7,5%

Классификация искусственных питательных сред По назначению Консервирующие – применяются для предотвращения отмирания бактерий в патологическом материале (Глицериново-солевая смесь), Основные – применяются для культивирования большинства бактерий (Питательные бульон и агар), Элективные – обеспечивают оптимальные условия для выращивания одного вида бактерий (Желточно-солевой бульон для стафилококка, желчный бульон для сальмонелл), Дифференциально-диагностические – применяются для изучения биохимических свойств при идентификации бактерий (Среды Гисса, Ресселя, Эндо)

Методы выделения чистых культур аэробов

Методы выделения чистых культур аэробов 1. Механическое разобщение клеток: а) метод Коха: готовят десятикратные разведения материала в хлориде натрия, из каждого разведения 1 петлю вносят в пробирку с агаром (400) и выливают его в чашку Петри; б) метод Дригальского: 1 петлю материала наносят на поверхность агара в чашку Петри и растирают шпателем, затем, не прожигая его, растирают по поверхности агара второй, а затем третьей чашки и т.д;

Методы выделения чистых культур аэробов 1. Механическое разобщение клеток: в) механическое разобщение петлей; г) количественный метод Голда: 1 мл жидкого или 1 г твердого материала вносят в 9 мл NaCl, затем 1 петлю материала наносят на чашку = делают 40 штрихов (сектор А), задевая штрихи сектора А, проводят 4 штриха (1-й сектор), аналогично засевают 2-й и 3-й секторы

Методы выделения чистых культур аэробов 2. Предварительная обработка материала с помощью физических или химических факторов. Например: 1) неспорообразующие бактерии уничтожают прогреванием при 80 0С 20 мин, споры при этом сохраняются; 2) для выделения микобактерий материал обрабатывают кислотой, при этом сопутствующая флора погибает

Методы выделения чистых культур аэробов 3. Избирательное подавление сопутствующих бактерий физическими или химическими факторами во время инкубации посевов. Например: для выделений иерсиний чумы посевы инкубируют при Т=5 0 4. Заражение чувствительных животных = для выделения возбудителя чумы из трупов грызунов 5. Использование биологических свойств бактерий. Например: метод Шукевича для выделения протея (ползучий рост).

Методы создания анаэробных условий для культивирования бактерий

Методы создания анаэробных условий для культивирования бактерий Физические Химические Биологические Метод Китта-Тароцци

Физические методы 1.культивирование в анаэростате (выкачивается воздух) или аппарате Киппа (замещается инертным газом, например азотом) 2. использование трубки Виньяла-Вейона (смешивание м/о с расплавленной и охлаждённой питательной средой с её последующим застыванием – глубинное культивирование) 3. посев уколом в высокий столбик (полужидкой среды)

Физические методы 4. культивирование под слоем масла 5. регенерация жидкой питательной среды перед засевом (кипячение с последующим быстрым охлаждением)

Химические методы А. Добавление в среду культивирования химических веществ = поглотителей кислорода, в замкнутом объёме протекает химическая реакция с поглощением кислорода 2 метода: метод Аристовского (сыпучие ингредиенты) метод Омелянского (жидкие ингредиенты), Б. включение в питательную среду редуцирующих веществ (связывают растворённый в среде кислород) глюкоза тиогликолевая кислота и др.

Биологические метод Фортнера (в замкнутом объёме культивируются анаэробы и жадный аэроб – после прекращения роста которого в безкислородной среде начинают расти анаэробы)

Метод Китта-Тароцци среда Китта-Тароцци МПБ с глюкозой на поверхности – масло (механическая защита) на дне – кусочки печени (для поглощения кислорода)

Этапы бактериологического исследования 1. Забор материала 2. Транспортировка 3. Посев на плотные питательные среды для получения изолированных колоний. 4. Выделение чистой культуры 5. Идентификация

1. Забор материала а) выбор материала определяется клинической картиной: - при заболеваниях верхних дыхательных путей – слизь из носа и зева, мокрота; - при заболеваниях желудочно-кишечного тракта – испражнения, промывные воды, рвотные массы; - при генерализованных формах – кровь; б) материал берут до начала лечения – антибиотики затрудняют выделение; в) в разные стадии заболевания берут разный материал- н-р, брюшной тиф г) материал берут асептически в стерильную посуду

2.Транспортировка а) необходимы специальные транспортные среды, б) важно соблюдать условия транспортировки: температура, влажность, время.

3. Посев материала на плотные питательные среды для получения изолированных колоний Колония – видимое скопление микроорганизмов, выросшее из одной бактериальной клетки на плотной питательной среде Изолированная колония – не соприкасается краями с другими колониями

4.Выделение чистой культуры и накопление биомассы: 4.1 . Изучение культуральных признаков 4.2. Изучение морфологических и тинкториальных (отношение к окраске) признаков = приготовление мазка и окраска по Граму 4.3. Посев на скошенный столбик элективной питательной среды 4.4. Проверка чистоты культуры = мазок, окраска по Граму

Культуральные признаки бактерий – это характер колоний на плотной питательной среде

5. Идентификация выделенной чистой культуры Это изучение биохимических и серологических свойств бактерий: А) Определение сахаролитических ферментов Б) Определение протеолитических ферментов

Определение сахаролитических ферментов = посев на «пестрый ряд» (среды Гисса – включают в себя углевод и индикатор Андреде). Для сбора газообразных продуктов в пробирки помещают поплавок. Различают: - Короткий «пестрый ряд» включает углеводы: глюкоза, лактоза, мальтоза, сахароза, маннит - Длинный «пестрый ряд» включает те же углеводы, что и короткий ряд: глюкоза, лактоза, мальтоза, сахароза, маннит и дополнительно в его состав входят: 1) моносахариды: арабиноза, ксилоза, рамноза, галактоза; 2) полисахариды: инулин, крахмал, гликоген; 3) спирты: глицерин, дульцит, инозит

Определение сахаролитических ферментов Принцип действия: утилизация содержащегося в среде углевода с образованием кислоты  сдвиг рН в кислую сторону  изменение цвета среды Разложение кислоты на газ и воду  Газ собирается в поплавке

Определение сахаролитических ферментов I. Среды Гисса = 'пестрый ряд': а - жидкая среда с углеводами и индикатором Андреде; б - полужидкая среда с индикатором ВР: 1 - микроорганизмы не ферментируют углевод; 2 - микроорганизмы ферментируют углевод с образованием кислоты; 3 - микроорганизмы ферментируют углевод с образованием кислоты и газа; II. - колонии микроорганизмов, не разлагающих (бесцветные) и разлагающих лактозу (фиолетовые на среде ЭМС - слева, красные на среде Эндо - справа)

Определение сахаролитических ферментов Учет результатов: Если цвет среды изменился, бактерии ферментируют этот углевод до кислых продуктов (ставят в таблице букву К). 2. Если наряду с изменением цвета среды в поплавке обнаруживается газ, бактерии ферментируют этот углевод до кислоты и газа (ставят – КГ). 3. Если цвет среды не изменился, бактерии не ферментируют этот углевод

Определение протеолитических ферментов = посев бактерий уколом в столбик 10-20% желатины и пептонную воду (в пробирку к пробке прикрепляют индикаторные бумажки: - 1. на индол = С8Н7N – Способ Эрлиха: в пробирку с культурой добавляют 2-3 мл эфира и реактив Эрлиха (спиртовый раствор пара-диметил-амино-бенз-альдегид с хлористоводородной кислотой →встряхивают → розовое окрашивание или + горячий насыщенный раствор щавелевой кислоты → красное),

Определение протеолитических ферментов - 2. сероводород – Н2S – бумажка, смоченная сульфатом железа → при выделении Н2S образуется нерастворимый сульфит железа → черная окраска - или в пробирку с питательной средой добавляют смесь солей (сульфат железа, тиосульфат натрия, сульфит натрия) и уколом засевают истыпуемый штамм → по ходу укола черное окрашивание, - 3. аммиак=N Н3 – лакмусовая бумажка.

Определение протеолитических ферментов Учет результатов: 1. При наличии протеолитических ферментов бактерии разжижают желатин, образуя «воронку» или «елочку». 2. При образовании газообразных продуктов разложения пептона бумажки меняют цвет: бумажка на аммиак – синеет, бумажка на сероводород - чернеет, бумажка на индол – розовеет.

Протеолитические свойства микроорганизмов. 1 - формы разжижения желатина; II - определение сероводорода; III - определение индола: 1 - отрицательный результат; 2 - положительный результат

Пестрый ряд для кишечной палочки

Определение наличия отдельных ферментов Для обнаружения каталазы на стекло наносят культуру и каплю 1-3% р-ра Н2О2 → пузырьки газа.

Определение наличия отдельных ферментов оксидазная активность = покраснение индикаторной бумажки

Определение гемолитической активности

Ускоренные методы биохимической идентификации СИБ = системы индикаторных бумажек = набор дисков, пропитанных субстратами, их вносят в пробирки или на чашки с чистой культурой. набор мультимикротестов =пластиковые планшеты, в лунки которых помещены субстраты с индикаторами → в лунки вносят бактерии, инкубируют 4 часа при 37о → учитывают результаты