ФИЗИОЛОГИЯ ГЕМОСТАЗА Струкова Светлана Михайловна 1 ПЕРВИЧНЫЙ ГЕМОСТАЗ

ФИЗИОЛОГИЯ ГЕМОСТАЗА Струкова Светлана Михайловна 1. ПЕРВИЧНЫЙ ГЕМОСТАЗ

ПАТОЛОГИИ ГЕМОСТАЗА • ТРОМБОЗЫ (атеротромбоз, тромботический инсульт, венозный тромбоз и др) • геморрагии, кровоточивость • синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания и др. (сочетание микротромбоза мелких сосудов и кровоточивости крупных ). Объем тромба Формирование Окклюзия, ишемия тромбоцитарной пробки Норма Геморрагия Время(сек-мин) Повреждение

3 ТИПА ПОВРЕЖДЕНИЙ ЭНДОТЕЛИЯ: – механические: травма, катеризация, балонная ангиопластика, острая гипертензия; – химические: гиперлипидемия, окисленные липопротеиды, продукты курения, свободные радикалы, токсические окислы; – иммунологические: специфические антитела против антигенов на поверхности клеток, эндотоксины, вирусы, цитокины медиаторы воспаления.

ЭТАПЫ ГЕМОСТАЗА ПЕРВИЧНЫЙ • ПОВРЕЖДЕНИЕ • РЕФЛЕКТОРНОЕ СУЖЕНИЕ СОСУДА • ОБРАЗОВАНИЕ ТРОМБОЦИТАРНОЙ ПРОБКИ( АДГЕЗИЯ КЛЕТОК И АГРЕГАЦИЯ КЛЕТОК) ВТОРИЧНЫЙ • ОБРАЗОВАНИЕ ТРОМБИНА • СВЕРТЫВАНИЕ ФИБРИНОГЕНА В СГУСТОК ФИБРИНА, ВКЛЮЧЕНИЕ КЛЕТОК В СГУСТОК, СТАБИЛИЗАЦИЯ АДГЕЗИВНЫМИ БЕЛКАМИ, ЛИЗИС ФИБРИНА (ФИБРИНОЛИЗ) ИЛИ ТРОМБООБРАЗОВАНИЕ

КИНЕТИКА ОСНОВНЫХ СОБЫТИЙ В ГЕМОСТАЗЕ ПЕРВИЧНЫЙ ГЕМОСТАЗ ВТОРИЧНЫЙ ГЕМОСТАЗ ФИБРИНОЛИЗ Вазоконстрикция Активация факторов свертывания Активация фибринолиза (Немедленно) (Секунды) (Минуты) Адгезия тромбоцитов Образование сгустка Лизис сгустка фибрина (Секунды) (Минуты) Агрегация тромбоцитов (Минуты) (часы)

ГЕМОСТАЗ ОБЕСПЕЧИВАЕТСЯ СИСТЕМАМИ: • СОСУДИСТОЙ • СВЕРТЫВАЮЩЕЙ • ПРОТИВОСВЕРТЫВАЮЩЕЙ (ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ И АНТИКОАГУЛЯНТНОЙ) ТРИ ЗВЕНА ГЕМОСТАЗА 1. КЛЕТКИ И КОМПОНЕНТЫ СТЕНКИ СОСУДА ( ЭНДОТЕЛИЯ , ГЛАДКОМЫШЕЧНЫЕ , ТУЧНЫЕ, ФИБРОБЛАСТЫ, адгезивные молекулы, рецепторы и др. ) 2. КЛЕТКИ КРОВИ ( ТРОМБОЦИТЫ, МОНОЦИТЫ И ДР, агонисты и рецепторы) 3. БЕЛКИ ПЛАЗМЫ КРОВИ ( 13 ФАКТОРОВ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ, АКТИВАТОРЫ И ИНГИБИТОРЫ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ И ФИБРИНОЛИЗА, БЕЛКИ СИСТЕМЫ ПРОТЕИНА С )

УЧАСТИЕ КЛЕТОК СТЕНКИ СОСУДА В ГЕМОСТАЗЕ Эндотелий- высокоспециализир. ткань контролирует: гемостаз, тонус сосудов, обмен питательных веществ, проницаемость сосуда, ангиогенез, воспаление, пролиферацию, атерогенез и тромбоз.

ГЕМОСТАТИЧЕСКИЙ БАЛАНС Сосудистая проходимость Ответ на повреждение антикоагулянты TFPI прокоагулянты Тромбоцитарные адгезивные белки и агонисты: Прокоагулянты стенки сосуда: v. WF, v. WF-Фон Виллебранда фактор; P-селектин ; TF-Тканевой фактор; PAI-1 -Ингибитор-1 активатора плазминогена; PGI 2 -простациклин; NO-оксид азота; CD 39 - АДФ-аза, TM –тромбомодулин; HS- гепарансульфат; TPA- Активатор плазминогена тканевого типа; TFPI- Ингибитор пути тканевого фактора.

ПРОКОАГУЛЯНТНЫЕ ФАКТОРЫ ЭНДОТЕЛИЯ Категории Термины Свойства Адгезивные белки VWF( фон Виллебранда фактор) Р- и Е-селектины ICAM-внутриклеточная VCAM-сосудистая Контакт с клетками крови и компонента ми внеклеточно го матрикса адгезивная молекула Факторы свертывания крови Тканевой фактор (ТФ) Ингибитор фибринолиза PAI-1 -ингибитор активаторов плазминогена Активаторы тромбоцитов PAF(фактор активации тромбоцитов) Связывание Ф VII/VIIa и инициация свертывания крови Блокирование активаторов плазминогенаt. PA и u. PA Активация тромбоцитов

АНТИКОАГУЛЯНТНЫЕ ФАКТОРЫ ЭНДОТЕЛИЯ Категория Термины Свойства Ингибиторы агрегации тромбоцитов PGI 2 (простациклин) NO AДФаза(CD 39) Ингибиторы агрегации тромбоцитов Ингибиторы факторов свертывания крови и кофакторы TFPI (ингибитор пути тканевого фактора) HS (гепаран сульфат) Ингибитор Ф Xa и VIIa; Рецепторы ТМ ( тромбомодулин) Активаторы плазминогена Кофактор антитромбина t. PA и u. PA Кофактор тромбина в активации протеина. С Активаторы Фибринолиза

СТАДИИ ПЕРВИЧНОГО ГЕМОСТАЗА Стадии Лиганды Рецепторы Инициирование v. WF Коллаген Фибриноген Фибронектин Ламинин Тромбоспондин 1 Витронектин GPIb/IX/V Тромбин AДФ Тромбоксан А 2 Адреналин Серотонин Фибриноген v. WF Фибронектин PAR 1, PAR 4, GPIb/IX/V P 2 Y 1, P 2 Y 12 TP 2 А 5 -HT 2 A IIb 3 GPIb/IX/V, IIb 3 5 1 Р-селектин CD 40 –лиганд PGI 2, NO, AДФ-аза PSGL-1 IIb 3 IP Прикрепление и адгезия тромбоцитов Распространение Активация тромбоцитов Агрегация Стабилизация Ингибирование 2 1, GPVI IIb 3 5 1 6 1 GPIb/IX/V, CD 36, 5 1

Локализация Р-селектина и VWF в тельцах Вейбела. Палейда клетки эндотелия пупочной вены человека Р-селектин, экспонируемый эндотелием, связывается с PSGL-1 тромбоцитов и др клеток и иммобилизует клетки PSGL-1 - Р-селектин связывающий лиганд

Доменная структура и реактивный центр (RGD) фактора фон Виллебранда (VWF) D’ D 3 A 1 A 2 A 3 D 4 1 272 C 1 C 2 RGD (R 1744 -D 1746) 2050 449 -728 (С 509 – С 695) B 1 B 2 (С 923 - С 1109) N C Фактор VIII Гепарин 1 - 272 1 -272; 565 -587 Коллаген 542 - 622; ГП Ib/IX/V 474 -488; 694 -708 948 -998 Интегрин 1744 -1746 IIb/ 3 ADAMTS 13 1605 -1606 VWF(Mr 500 -20000 k. Da) (D’-D 3 -A 1 -A 2 -A 3 -D 4 -B 1 -В 2 -C 1 -C 2) N( NH 2)- конец молекулы v. WF , С(СООН)-конец v. WF, RGD –Арг-Гли-Асп

De Meyer, 2012

ОСВОБОЖДЕНИЕ МУЛЬТИМЕРОВ VWF (ULVWF) И ПРОТЕОЛИЗ ИХ ADAMTS 13 до VWF (Mr 500 -10000 k. Da) ADAMTS 13 -дизинтегрин и металлопротеиназа с тромбоспондиновым мотивом

ДОМЕНЫ VWF ОТВЕЧАЮТ ЗА СВЯЗЫВАНИЕ С ТРОМБОЦИТАМИ И КОЛЛАГЕНОМ

VWF связывает ГПIb тромбоцита, активирует клетку и стимулирует конформационную перестройку интегрина a. IIb 3 ПЕПТИД RGD ( Arg-Gly-Asp) реактивный участок VWF и других адгезивных молекул (фибриногена , фибронектина и др) VWF(Mr 500 -10000 k. Da) (D’-D 3 -A 1 -A 2 -A 3 -D 4 -B-C 1 -C 2) АКТИВАЦИЯ И ЭКСПОНИРОВАНИЕ ИНТЕГРИНА a. IIb 3–КРИТИЧЕСКАЯ СТАДИЯ В ГЕМОСТАЗЕ И ТРОМБОЗЕ

АДГЕЗИЯ И АГРЕГАЦИЯ ТРОМБОЦИТОВ VWF отвечает за адгезию тромбоцитов в участке повреждения сосудов с высоким напряжением сдвига и скоростью сдвига (s 1 ). В НОРМАЛЬНОЙ ЦИРКУЛЯЦИИ наибольшие величины скоростей сдвига в артериях и артериолах (со средней величиной 1700 s-1). Скорости сдвига возрастают более чем на порядок в стенозированных а участках артерий. При окклюзии коронарной артерии до 90% скорости сдвига могут возрасти до 20000 -40000 s-1.

Адгезия и агрегация тромбоцитов МОДЕЛЬ ЛИГАНД-РЕЦЕПТОРНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРИ ПОВРЕЖДЕНИИ ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДА И ЭКСПОНИРОВАНИИ ФАКТОРА ФОН ВИЛЛЕБРАНДА И КОЛЛАГЕНА

Мультидоменная структура димера фибронектина Фибронектин(ФН)– компонент соединительнотканного матрикса. Домены ФН связывают: коллаген, фибрин, гепарин. . . , NH 2 домен ФН ( блок типа I ) связывает фибрин. Блок типа III содержит пептид RGD, связывающий ФН с клеткой. ФН легко полимеризуется и образует сеть нерастворимых фибрилл матрикса. На этом матриксе адгезируют клетки, связываясь с реактивным доменом, содержащим пептид RGD

ПЕРВИЧНЫЙ ГЕМОСТАЗ- тромбоциты

СТРУКТУРА ТРОМБОЦИТА Тромбоциты – небольшие (0, 5 -3, 0 мкм), дисковидные, безъядерные клетки, содержат множество гранул: α- гранулы, плотные , лизосомы, органеллы, две системы трубок: систему открытых каналов и плотную тубулярную систему. Система открытых каналов Митохондрии Гликоген Рецепторы: Конститутивные : ГП Ib/V/IX, ГПVI, PAR 1, 4 Плотная тубулярная система Микротрубочки Индуцируемые: Интегрины IIb 3, 2 1 Микротрубочки - Плотные Гранулы гранулы( ) Лизосомальны егранулы

ОБРАЗОВАНИЕ ТРОМБОЦИТОВ ИЗ МЕГАКАРИОЦИТА СТВОЛОВАЯ КЛЕТКА (детерминированная к миелопоэзу) МЕГАКРИОБЛАСТ ПРОМЕГАКАРИОЦИТ ПАУКООБРАЗНЫЕ КЛЕТКИ(С ОТРОСТКАМИ ПРОТРОМБОЦИТАМИ) ТРОМБОЦИТЫ

Формирование и отшнуровка от мегакариоцитов тяжей, именуемых протромбоцитами Hartwig, 2003 В крови здоровых людей протромбоциты составляют около 3% Бурячковская, 2008

Цитоскелет мембраны тромбоцита Интегрины, активированные агонистами, образуют надмолекулярные комплексы с белками: структурными (винкулин, талин , актинины(АВР)-связывающие актин с интегринами), регуляторными (тирозинкиназы сигналинга) и адапторными, связывающими между собой белки комплекса адгезии.

СТАДИИ ПЕРВИЧНОГО ГЕМОСТАЗА Стадии Лиганды Рецепторы Инициирование Фактор фон Виллебранда GPIb/IX/V Прикрепление и адгезия тромбоцитов Распространение Активация тромбоцитов Агрегация (v. WF) Коллаген Фибриноген Фибронектин Ламинин Тромбоспондин 1 Витронектин GPVI, 2 1 IIb 3 5 1 6 1 GPIb/IX/V, CD 36 5 1 Тромбин AДФ Коллаген Тромбоксан А 2 Адреналин Серотонин Фибриноген v. WF PAR 1, PAR 4, GPIb/IX/V P 2 Y 1, P 2 Y 12 GPVI, 2 1 TP 2 А 5 -HT 2 A IIb 3 GPIb/IX/V, IIb 3 Стабилизация Р-селектин CD 40 -лиганд PSGL-1 IIb 3 Ингибирование PGI 2, NO, ADP-аза IP

ИНДУКТОРЫ АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ И СЕКРЕТИРУЕМЫЕ активированными клетками компоненты гранул СИЛЬНЫЕ АГОНИСТЫ: Тромбин, TXA 2, PAF, >[АДФ] Коллаген СЛАБЫЕ: < АДФ, Адреналин Серотонин Tx. A 2 - тромбоксан А 2, PAF- фактор ( активации тр-цитов, Fg-фибр-ген, Fnфибронектин, TS-1 -тромбоспондин, TFтканевой фактор, TFPI-ингибитор пути TF, AT-антитромбин, Plg-плазминоген, PAI-1 -ингибитор активаторов плазминогена, u. PA-активатор плазминогена урокиназного типа, α 2 -AP - α 2 -антиплазмин, α 2 -Mg- α 2 макроглобулин, TAFI-ингибитор фибринолиза активируемый тромбином, PDGF- фактор роста, производимый тромбоцитами, EGF-эндотелиальный GF, VEGF –GF эндотелия сосудов, b. FGF- b. GF-фибробластов, MIP-1 - воспалительный белок макрофагов, IL-1βинтерлейкин 1β , PF 4 - тромбоцитарный фактор4, β-TG- β-тромбоглобулин, GPIbгликопротеин. Ib, PS-фосфатидил-серин, CD 40 L- CD 40 лиганд, PECAM-1 -молекула 1 адгезии тромбоцитов к эндотелию, АДФаденозиндифосфат - ГРАНУЛЫ: Адгезивные белки(v. WF, Fg, Fn, TS-1) Факторы свертывания, иингибиторы (V/Va, XI, TFPI, AT) Факторы фибринолиза (Plg, PAI-1, u. PA, α 2 - AP, α 2 -Mg, TAFI) Факторы роста, цитокины, хемокины PDGF, EGF, VEGF(A, C), b. FGF, MIP-1, TGFβ-1, -2, IL-1β) Основные белки (PF 4, β-TG, эндостатины Мембранные ГП ) ( GPIb, αIIbβ 3, ανβ 3, PS, CD 40 L, PECAM-1, TF, ПЛОТНЫЕ ГРАНУЛЫ( ): AДФ, АТФ, Са 2+, Серотонин, гистамин, катехоламины ЛИЗОСОМАЛЬНЫЕ ГРАНУЛЫ : кислые гидролазы, катепсин G, коллагеназа. G

Система открытых каналов в тромбоците

Морфология тромбоцитов человека DB-плотные гранулы, РР- псевдоподии 2005

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ТРОМБОЦИТА, АКТИВИРОВАННОГО ТРОМБИНОМ

АКТИВАЦИЯ ТРОМБОЦИТОВ ТРОМБИНОМ ТРОМБИН Активация PAR-1 через гетеротримерные G 12/13α, Gq 11α и Giα белки. G 12/13α связывается с факторами , ускоряющими обмен ГДФ на ГТФ (GEFs), в малых Gбелках, как Rho, приводя к активации. Rho/Rhoкиназ (ROCK). Gq 11α связывается с PLC , приводя к образованию IP 3, который мобилизует Ca 2+, и DAG, кот активирует PKC. Giα ингибирует аденилатциклазу и снижает с. АМР.

РЕЦЕПТОРЫ АДФ (ADP) Обратимую агрегацию вызывает АДФ (в низк. конц. ) через P 2 Y 1, активацию PLCβ, освоб. [Са 2+ ]i, экспонирование. IIb/ 3. 2008 АТР через P 2 X 1 отвечает за быстрый вход Са 2+ в клетку и изменение формы тромбоцита. НЕОБРАТИМУЮ АГРЕГАЦИЮ и реакцию высвобождения вызывают высокие конц АДФ через P 2 Y 12 , активация которого ведет к ингибированию аденилатциклазы, снижению ц АМФ и продолжительной агрегации и секреции.

КОЛЛАГЕН активирует два рецептора- сначала GPVI, ЗАТЕМ 2 1 и обеспечивает устойчивую адгезию и агрегацию тромбоцитов Передача сигнала от GPVI, активированного коллагеном, ведет к : 1. активации фосфолипазы С (PLC) , повышению [ Сa 2+ ]i ), освобождению ADP ; 2. перестройке и экспонированию на поверхность интегрина 2 1; 3. экспонированию на поверхность интегрина IIb 3. ADP

МЕТАБОЛИЗМ АРАХИДОНОВОЙ КИСЛОТЫ В ТРОМБОЦИТАХ И ЭНДОТЕЛИИ COX 1 Эндотелий Тромбоциты PGS Простациклин TXS Тромбоксан А 2 COX 1 - циклооксигеназа 1, PGS- PGI 2 -синтаза, TXS-TXA 2 синтаза

АКТИВАЦИЯ ТРОМБОЦИТОВ ЧЕРЕЗ СЕМИДОМЕННЫЕ , СОПРЯЖЕННЫЕ С G-БЕЛКАМИ РЕЦЕПТОРЫ

PGI 2 активирует АС, а NO - s. GC, которые катализируют образование с. AMP и c. GMP ( соответственно) и снижение [Ca 2+] в клетках s. GC - растворимая гуанилатциклаза, . GTP- гуанозинтрифосфат , c. GMP- циклический гуанозин- монофосфат, c. GMP-зависимая протеинкиназа (c. GK). PGI 2 – простациклин, АС -аденилатциклаза, с AMP- циклический аденозин- монофосфат, c. AMP- зависимая протеинкиназа (с. АК, PKA)

Вазодилататорное действие простациклина и оксида азота AC –аденилатциклаза; GC-гуанилатциклаза; GPCR-рецептор, связанный с G-белком;

Участие тромбоцитов в сопряжении процессов гемостаза, воспаления и иммунных ответов Jenne et al. , 2013 (Int. J. Lab. Hematol, 35, 254)