Физиология бактерий и методы её изучения. Кудьтивирование бактерий.
Физиология бактерий изучает жизненные функции микроорганизмов: питание, дыхание, рост и размножение. В основе лежит непрерывный обмен веществ – метаболизм. Различают 2 его стороны: анаболиз и катаболизм. Анаболиз (ассимиляция) – процесс синтеза или ресинтеза новых, более сложных, соединений из более простых, протекающий с расходованием, затратой энергии АТФ, т. е. это совокупность реакций , обеспечивающих синтез клеточных структур. Катаболизм (диссимиляция) – или энергетический обмен — процесс метаболического распада, разложения на более простые вещества (дифференциация) или окисления какого-либо вещества, обычно протекающий с высвобождением энергии в виде тепла и в виде АТФ, т. е. это совокупность реакций, обеспечивающих клетку энергией.
Химический состав бактериальной клетки Бактериальная клетка на 80 -90% состоит из воды и только 10% приходится на долю сухого вещества. Вода в клетке находится в свободном или связанном состоянии. Она выполняет механическую роль в обеспечении тургора, участвует в гидролитических реакциях. Удаление воды из клетки путем высушивания приводит к приостановке процессов метаболизма, прекращению размножения, а для многих микроорганизмов губительно. В то же время особый способ высушивания микроорганизмов в вакууме из замороженного состояния (лиофилизация) обеспечивает сохранение жизнеспособности большинства микроорганизмов. Лиофилизация используется для приготовления проб, пригодных для длительного хранения.
В сухом веществе бактерий 52% составляют белки, 17% - углеводы, 9% липиды, 16% - РНК, 3% - ДНК и 3% - минеральные вещества. Белки являются ферментами, а также составной частью клетки, входят в состав цитоплазматической мембраны (ЦПМ) и ее производных, клеточной стенки, жгутиков, спор и некоторых капсул. Некоторые бактериальные белки являются антигенами и токсинами бактерий. Углеводы представлены в бактериальной клетке в виде моно-, ди-, олигосахаров и полисахаридов, а также входят в состав комплексных соединений с белками, липидами и другими соединениями. Полисахариды входят в состав некоторых капсул, клеточной стенки; крахмал и гликоген являются запасными питательными веществами. Некоторые полисахариды принимают участие в формировании антигенов. Липиды или жиры входят в состав ЦПМ и ее производных, клеточной стенки грамотрицательных бактерий, а также служат запасными веществами, входят в состав эндотоксина грамотрицательных бактерий, в составе ЛПС формируют антигены. Общее кол-во липидов зависит от возраста и вида м/о. Например у микобактерий туберкулёза кол-во липидов достигает 40%, что обуславливает устойчивость этих бактерий к факторам внешней среды.
Минеральные вещества обнаруживаются в золе, полученной после сжигания клеток. В большом количестве представлены N, S, Р, Са, К, Mg, Fe, Mn, а также микроэлементы Zn, Cu, Co. Азот входит в состав белков, нуклеотидов, коферментов. Сера входит в виде сульфгидрильных групп в структуру белков. Фосфор в виде фосфатов представлен в нуклеиновых кислотах, АТФ, коферментах. В качестве активаторов ферментов используются ионы Mg, Fe, Mn. Ионы К и Mg необходимы для активации рибосом. Са является составной частью клеточной стенки грамположительных бактерий. У многих бактерий имеются сидерохромы, которые обеспечивают транспортировку ионов Fe внутрь клетки в виде растворимых комплексных соединений.
Механизмы питания бактерий Обмен происходит между клеткой и внешней средой и контролируется клеточной мембраной. Она проницаема для многих веществ, поток идёт в двух направлениях (из клетки и в клетку), но структура мембраны такова, что она обладает избирательной и неравномерной проницаемостью, определяющей 3 механизма питания бактерий: I. Пассивная диффузия- осуществляется за счёт различного содержания веществ в среде и в клетке, происходит в направлении от большей концентрации к меньшей. Когда концентрация вещества по ту и другую сторону мембраны уравнивается, пассивная диффузия прекращается. Таким путём в клетку поступает и покидает её вода с растворенными в ней мелкими молекулами, способными проходить через мелкие поры мембраны. Эта диффузия не специфична и не требует затрат энергии.
II. Облегчённая диффузия– протекает при обязательном участие специфических белков локализованных (находящихся) на мембране. Они названы пермеазы (от англ. permeate – проникать, проходить сквозь). Свойство пермеаз – способность проходить через мембрану с присоединённой молекулой субстрата. III. Активный транспорт– с его помощью растворенные вещества поступают в клетку, что требует затрат энергии. У бактерий этот механизм питания – преобладающий. У многих бактерий, особенно грамотрицательных в активном транспорте принимают участие особые связывающие белки, локализованные в периплазматическом пространстве, они обладают сродством к различным питательным веществам – аминокислотам, сахарам, неорганическим ионам. Связывающие белки образуют прочные комплексы с субстратами и необходимы для переноса через мембрану. Функционируют связывающие белки только вместе с пермеазами. В ряде случаев транспортируемое в-во может подвергаться химической модификации – это транслокация химических групп.
Классификация бактерий по типам питания и способам получения энергии Основной целью метаболизма бактерий является рост, т. е. координированное увеличение всех компонентов клетки. Поскольку основными компонентами бактериальной клетки являются органические соединения, белки, углеводы, нуклеиновые кислоты и липиды, остов которых построен из атомов углерода, то для роста требуется постоянный приток атомов углерода. В зависимости от источника усвояемого углерода бактерии подразделяют на аутотрофы (от греч. autos - сам, trophe питание), которые используют для построения своих клеток неорганический углерод, в виде СО 2, и гетеротрофы (от греч. heteros - другой), которые используют органический углерод. Легкоусвояемыми источниками органического углерода являются гексозы, многоатомные спирты, аминокислоты, липиды.
Белки, жиры, углеводы и нуклеиновые кислоты являются крупными полимерными молекулами, которые синтезируются из мономеров в реакциях поликонденсации, протекающих с поглощением энергии. Поэтому для восполнения своей биомассы бактериям, помимо источника углерода, требуется источник энергии. Энергия запасается бактериальной клеткой в форме молекул АТФ. Организмы, для которых источником энергии является свет, называются фототрофами. Те организмы, которые получают энергию за счет окислительно-восстановительных реакций, называются хемотрофами. Среди хемотрофов выделяют литотрофы (от греч. lithos - камень), способные использовать неорганические доноры электронов (Н 2, NH 3, H 2 S, Fe 2+ и др. ) и органотрофы, которые используют в качестве доноров электронов органические соединения.
Бактерии, изучаемые медицинской микробиологией, являются гетерохемоорганотрофами. Отличительной особенностью этой группы является то, что источник углерода у них является источником энергии. Степень гетеротрофности у различных бактерий неодинакова. Среди бактерий выделяют сапрофиты (от греч. sapros - гнилой, phyton - растение), которые питаются мертвым органическим материалом и независимы от других организмов, и паразиты (от греч. parasites - нахлебник) - гетеротрофные микроорганизмы, получающие питательные вещества от макроорганизма. Среди паразитов различают облигатные и факультативные. Облигатные паразиты полностью лишены возможности жить вне клеток макроорганизма. К ним относятся представители родов Rickettsia, Coxiella, Ehrlichia, Chlamydia и др. , размножающиеся только внутри клеток макроорганизма. Факультативные паразиты могут жить и без хозяина и размножаться, так же как и сапрофиты, на питательных средах in vitro, т. е. вне организма.
Культивирование бактерий в системах in vitro осуществляется на питательных средах. Искусственные питательные среды должны отвечать следующим требованиям. • Каждая питательная среда должна содержать воду, так как все процессы жизнедеятельности бактерий протекают в воде. • Для культивирования гетероорганотрофных бактерий в среде должен содержаться органический источник углерода и энергии. Эту функцию выполняют различные органические соединения: углеводы, аминокислоты, органические кислоты, липиды. Наибольшим энергетическим потенциалом обладает глюкоза, так как она непосредственно подвергается расщеплению с образованием АТФ и ингредиентов для биосинтетических путей. Часто используется в этих целях пептон - продукт неполного гидролиза белков, состоящий из поли-, олиго- и дипептидов. Пептон также поставляет аминокислоты для построения бактериальных белков.
Пептон (англ. Peptone) — препарат, полученный из молока и мяса животных под действием протеолитических ферментов (если используется трипсин, то такой пептон называется триптон). На начальных стадиях процесса переваривания белков под действием ферментов, например, пепсина образуются крупные белковые фрагменты, которые и называются пептонами. Кроме коротких пептидов, обычно пептоны содержит жиры, металлы, соли, витамины и много других органических и минеральных веществ.
Для синтеза белков, нуклеотидов, АТФ, коферментов бактериям требуются источники азота, серы, фосфаты и другие минеральные вещества, в том числе микроэлементы. Источником азота может служить пептон; кроме того, большинство бактерий способны использовать соли аммония в качестве источника азота. Серу и фосфор бактерии способны утилизировать в виде неорганических солей: сульфатов и фосфатов. Для нормального функционирования ферментов бактериям требуются ионы Са 2+, Mg 2+, Mn 2+, Fe 2+, которые добавляют в питательную среду в виде солей, чаще всего фосфатов. • Решающее значение для роста многих микроорганизмов имеет р. Н среды. Поддерживание определенного р. Н имеет значение для предотвращения гибели микроорганизмов от ими же образованных продуктов обмена.
• Среда должна обладать определенным осмотическим давлением. Большинство бактерий способны расти на изотоничных средах, изотоничность которых достигается добавлением Na. Cl в концентрации 0, 87%. Некоторые бактерии не способны расти на средах при концентрации соли в них ниже 1%. Такие бактерии называются галофильными. Так как устойчивость к осмотическому давлению определяется наличием у бактерий клеточной стенки, бактерии, лишенные клеточной стенки, микоплазмы L-формы, могут расти на питательных средах, содержащих гипертонический раствор, обычно сахарозы. При необходимости к питательной среде добавляют факторы роста, ингибиторы роста определенных бактерий, субстраты для действия ферментов, индикаторы. • Питательные среды должны быть стерильными.
В зависимости от консистенции питательные среды могут быть жидкими, полужидкими и плотными. Плотность среды достигается добавлением агара. Агар - полисахарид, получаемый из водорослей. Он плавится при температуре 100 °С, но при охлаждении остывает при температуре 45 -50 °С. Агар добавляют в концентрации 0, 5% для полужидких сред и 1, 5 -2% для создания плотных сред. В зависимости от состава и цели применения различают простые, сложные, элективные, минимальные, дифференциально-диагностические и комбинированные среды.
По составу питательные среды могут быть простыми и сложными. К простым средам относятся пептонная вода, питательный бульон, мясопептонный агар. На основе простых сред готовят сложные среды, например сахарный и сывороточный бульоны, кровяной агар. В зависимости от назначения среды подразделяются на элективные, обогащения, дифференциально-диагностические. Под элективными понимают среды, на которых лучше растет какой-то определенный микроорганизм. Например, щелочной агар, имеющий р. Н 9, 0, служит для выделения холерного вибриона. Другие бактерии, в частности кишечная палочка, из-за высокого р. Н на этой среде не растут. Среды обогащения - это среды, которые стимулируют рост какогото определенного микроорганизма, ингибируя рост других. Например, среда, содержащая селенит натрия, стимулирует рост бактерий рода Salmonella, ингибируя рост кишечной палочки.
Дифференциально-диагностические среды служат для изучения ферментативной активности бактерий. Они состоят из простой питательной среды с добавлением субстрата, на который должен подействовать фермент, и индикатора, меняющего свой цвет в результате ферментативного превращения субстрата. Примером таких сред являются среды Гисса, используемые для изучения способности бактерий ферментировать сахара. Комбинированные питательные среды сочетают в себе элективную среду, подавляющую рост сопутствующей флоры, и дифференциальную среду, диагностирующую ферментативную активность выделяемого микроба. Примером таких сред служат среда Плоскирева и висмут-сульфитный агар, используемые при выделении патогенных кишечных бактерий. Обе эти среды ингибируют рост кишечной палочки.
Ферменты бактерий В основе всех метаболических реакций в бактериальной клетке лежит деятельность ферментов, которые принадлежат к 6 классам: оксиредуктазы, трансферазы, гидролазы, лигазы, лиазы, изомеразы. Ферменты, образуемые бактериальной клеткой, могут как локализоваться внутри клетки - эндоферменты, так и выделяться в окружающую среду - экзоферменты. Экзоферменты играют большую роль в обеспечении бактериальной клетки доступными для проникновения внутрь источниками углерода и энергии. Ферменты могут быть локализованы в периплазматическом пространстве бактериальной клетки. Они участвуют в процессах переноса веществ в бактериальную клетку. Большинство гидролаз являются экзоферментами, которые, выделяясь в окружающую среду, расщепляют крупные молекулы пептидов, полисахаридов, липидов до мономеров и димеров, способных проникнуть внутрь клетки.
Ряд экзоферментов, например гиалуронидаза, коллагеназа, являются ферментами агрессии. Гиалуронидаза стрептококков, например, расщепляет гиалуроновую кислоту в мембранах клеток соединительных тканей макроорганизма , что способствует распространению возбудителей и их токсинов в организме, обуславливая высокую инвазивность этих бактерий. Плазмокоагулаза является главным фактором патогенности стафилококков, так как участвует в превращении протромбина в тромбин, который вызывает образование фибриногена, в результате чего каждая бактерия покрывается пленкой, предохраняющей ее от фагоцитоза.
Ферменты бактерий обладают высокой специфичностью, и именно это свойство широко используется при идентификации и определении видов микроорганизмов. Для идентификации бактерий разработаны специальные тест-системы, состоящие из набора дифференциально-диагностических сред. Наибольшее значение имеет определение сахаролитических (ферментация сахаров) и протеолитических (разложение белков) свойств. Микробные ферменты широко используются в медицине и промышленности. Так, получаемые из Aspergillus niger кислотоустойчивая амилаза и протеаза применяются как лекарства, способствующие пищеварению; с этой же целью используются липаза (из Rhizopus) и диастаза (из Aspergillus orizae). Для заживления ран и ожогов могут применяться стрептокиназа (из Streptococcus sp. ) и коллагеназа (из CI. hislolyticum).
Дыхание бактерий С питанием бактерий тесно связаны процессы дыхания, дающие необходимую энергию для осуществления физиологических функций клетки. Сущность процесса дыхания бактерий заключается в совокупности биохимических реакций, в ходе которых идет образование АТФ, без которого невозможен процесс метаболизма, протекающего с затратой энергии. АТФ является универсальным переносчиком химической энергии между процессами, выделяющими энергию, и реакциями, их использующими. При дыхании — процессе биологического окисления бактерий — потребляются те же соединения, что и на построение отдельных структурных компонентов клетки, но в первую очередь — сахара, спирты, органические кислоты, жиры и т. д.
Большая часть бактерий использует в процессе дыхания свободный кислород. Такие микроорганизмы получили название аэробные (от аег — воздух). Аэробный тип дыхания характеризуется тем, что окисление органических соединений происходит при участии кислорода воздуха с освобождением большого количества калорий. Молекулярный кислород выполняет роль акцептора водорода, образующегося при аэробном расщеплении этих соединений. Примером может служить окисление глюкозы в аэробных условиях, которое приводит к выделению большого количества энергии: С 6 Н 12 О 6 + 602 6 С 02+6 Н 20 + 688, 5 ккал.
Процесс анаэробного дыхания микробов заключается в том, что бактерии получают энергию при окислительно-восстановительных реакциях, при которых акцептором водорода является не кислород, а неорганические соединения — нитрат или сульфат. Многие бактерии могут существовать в аэробных и анаэробных условиях. Такие микроорганизмы получили название факультативных (необязательных) анаэробов. Например, стафилококки, кишечная палочка и другие факультативные анаэробы имеют полный набор дыхательных ферментов, обеспечивающих им существование как в кислородной, так и в безкислородной среде. Факультативные анаэробы обладают так называемым нитратным дыханием, так как образующийся при окислении органических соединений нитрат (акцептор водорода) восстанавливается до молекулярного азота и аммиака.
Обязательные анаэробы Облигатные (обязательные) анаэробы могут существовать лишь в строго анаэробных условиях. Среди патогенных — это возбудители столбняка, газовой гангрены, ботулизма. Облигатные анаэробы при окислении органических соединений образуют сульфат, который восстанавливается до сероводорода, поэтому облигатное дыхание называют еще сульфатным. В присутствии кислорода рост облигатных анаэробов прекращается. Это связано с тем, что жизнь в аэробных условиях приводит к тому, что конечным продуктом окисления органических соединений оказывается перекись водорода, а поскольку анаэробы не продуцируют фермент каталазу, расщепляющую перекись водорода, то она накапливается и оказывает токсическое действие на анаэробные бактерии.
Ферментативный метаболизм. Ферментация, или брожение, - процесс получения энергии, при котором отщепленный от субстрата водород переносится на органические соединения. Кислород в процессе брожения участия не принимает. Восстановленные органические соединения выделяются в питательную среду и накапливаются в ней. Ферментироваться могут углеводы, аминокислоты (за исключением ароматических), пурины, пиримидины, многоатомные спирты. Не способны сбраживаться ароматические углеводороды, стероиды, каротиноиды, жирные кислоты. Эти вещества разлагаются и окисляются только в присутствии кислорода, в анаэробных условиях они стабильны. Продуктами брожения являются кислоты, газы, спирты.
Спиртовое брожение встречается в основном у дрожжей. Конечными продуктами являются этанол и СО 2. Спиртовое брожение используется в хлебопекарной промышленности и виноделии. Молочнокислое брожение происходит у S. pyogenes, E. faecalis, S. Salivarius, а также у бактерий родов Lactobacillus и Bifidobacterium. Продуктами этого типа брожения являются молочная кислота, этанол и уксусная кислота. Продукты молочнокислого брожения играют большую роль в формировании колонизационной резистентности бактериями рода Lactobacillus и Bifidobacterium, составляющих облигатную флору кишечника. Молочнокислые бактерии широко используются в молочной промышленности для получения молочнокислых продуктов, а также в создании пробиотиков.
Маслянокислое брожение. Масляная кислота, бутанол, ацетон, изопропанол и ряд других органических кислот, в частности уксусная, капроновая, валериановая, пальмитиновая, являются продуктами сбраживания углеводов сахаролитическими строгими анаэробами. Спектр этих кислот, определяемый при помощи газожидкостной хроматографии, используется как экспресс-метод при идентификации анаэробов. Ферментация белков. Если для бактерий с бродильным метаболизмом источником энергии служат белки, то такие бактерии называются пептолитическими. Пептолитическими являются некоторые клостридии, в частности С. histolyticum и C. botulinum. Пептолитические бактерии гидролизуют белки и сбраживают аминокислоты
Рост и размножение бактерий Рост бактерий – увеличение бактериальной клетки в размерах без увеличения числа особей в популяции. Многие факторы — детергенты, антибиотики, соли жёлчных кислот, УФ-облучение — задерживают деление клеток. В результате образуются длинные нитевидные формы, значительно превышающие по размерам исходные клетки. Размножение бактерий – процесс, обеспечивающий увеличение числа особей в популяции. Бактерии характеризуются высокой скоростью размножения. Рост всегда предшествует размножению. Бактерии размножаются поперечным бинарным делением, при котором из одной материнской клетки образуются две одинаковые дочерние.
Процесс деления бактериальной клетки начинается с репликации хромосомной ДНК. В точке прикрепления хромосомы к цитоплазматической мембране (точке-репликаторе) действует белок-инициатор, который вызывает разрыв кольца хромосомы, и далее идет деспирализация ее нитей. Нити раскручиваются, и вторая нить прикрепляется к цитоплазматической мембране в точке-прорепликаторе, которая диаметрально противоположна точке-репликатору. За счет ДНК-полимераз по матрице каждой нити достраивается точная ее копия. Удвоение генетического материала – сигнал для удвоения числа органелл. В септальных мезосомах идет построение перегородки, делящей клетку пополам. Двухнитевая ДНК спирализуется, скручивается в кольцо в точке прикрепления к цитоплазматической мембране. Это является сигналом для расхождения клеток по септе. Образуются две дочерние особи.
Размножение бактерий определяется временем генерации. Это период, в течение которого осуществляется деление клетки. Продолжительность генерации зависит от вида бактерий, возраста, состава питательной среды, температуры и др. Фазы размножение бактериальной клетки на жидкой питательной среде: 1) начальная стационарная фаза; то количество бактерий, которое попало в питательную среду и в ней находится; 2) лаг-фаза (фаза покоя); продолжительность – 3– 4 ч, происходит адаптация бактерий к питательной среде, начинается активный рост клеток, но активного размножения еще нет; в это время увеличивается количество белка, РНК; 3) фаза логарифмического размножения; активно идут процессы размножения клеток в популяции, размножение преобладает над гибелью;
4) максимальная стационарная фаза; бактерии достигают максимальной концентрации, т. е. максимального количества жизнеспособных особей в популяции; количество погибших бактерий равно количеству образующихся; дальнейшего увеличения числа особей не происходит; 5) фаза ускоренной гибели; процессы гибели преобладают над процессом размножения, так как истощаются питательные субстраты в среде. Накапливаются токсические продукты, продукты метаболизма. Этой фазы можно избежать, если использовать метод проточного культивирования: из питательной среды постоянно удаляются продукты метаболизма и восполняются питательные вещества.
Спасибо за внимание
Скачать презентацию Физиология бактерий и методы её изучения Кудьтивирование бактерий
3,2Микробиология.Физиология бактерий и методы её изучения.pptx