Скачать презентацию ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ ЧАСТЬ 3 Электроблоттинг ПРИНЦИП Скачать презентацию ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ ЧАСТЬ 3 Электроблоттинг ПРИНЦИП

занятие3 ЭФ белков и элблоттинг.ppt

  • Количество слайдов: 19

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ. ЧАСТЬ 3. Электроблоттинг ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ. ЧАСТЬ 3. Электроблоттинг

ПРИНЦИП ЭЛЕКТРОФОРЕЗА. Разделение биополимеров по Ø размерам (молекулярной массе), Øпространственной конфигурации, Øвторичной структуре, Øэлектрическому ПРИНЦИП ЭЛЕКТРОФОРЕЗА. Разделение биополимеров по Ø размерам (молекулярной массе), Øпространственной конфигурации, Øвторичной структуре, Øэлектрическому заряду.

ПРИНЦИП ЭЛЕКТРОФОРЕЗА. ПАРАМЕТРЫ ПРОЦЕССА. üИонный состав и ионная сила электрофоретических буферов üТемпература üЗначение р. ПРИНЦИП ЭЛЕКТРОФОРЕЗА. ПАРАМЕТРЫ ПРОЦЕССА. üИонный состав и ионная сила электрофоретических буферов üТемпература üЗначение р. Н буфера üНапряжение электрического тока üТип, пористость и вязкость неподвижной фазы (электрофоретического геля)

Подвижность макромолекул в полиакриламидном геле обратно пропорциональна среднему размеру пор (формула Фергюсона): Lg U Подвижность макромолекул в полиакриламидном геле обратно пропорциональна среднему размеру пор (формула Фергюсона): Lg U = lg U 0 – Kr Т Kr – коэффициент задержки; U – подвижность макромолекул в геле; U 0 – подвижность макромолекул в свободном растворе; Т – плотность геля (концентрация мономеров)

SDS – ЭЛЕКТРОФОРЕЗ C 12 H 25 OSO 3 Na Фракционирование белков в зависимости SDS – ЭЛЕКТРОФОРЕЗ C 12 H 25 OSO 3 Na Фракционирование белков в зависимости от электрического заряда молекулы белка Фракционирование белков в зависимости от РАЗМЕРА белковой молекулы (от молекулярной массы)!

ПААГ характеризуется процентным содержанием мономеров (Т) и количеством сшивающего агента в процентах от общего ПААГ характеризуется процентным содержанием мономеров (Т) и количеством сшивающего агента в процентах от общего количества мономеров (С): • a – количество акриламида в г; • b – количество сшивающего мономера в г; • m – количество буфера в мл. • Установлено, что при получении гелей для электрофореза необходимо соблюдать следующее правило: чем выше концентрация акриламида, тем ниже должна быть концентрация бисакриламида, и наоборот.

БУФЕРНЫЕ СИСТЕМЫ. ВЫБОР КОНЦЕНТРАЦИИ ГЕЛЯ. Для обеспечения хорошей электрофоретической подвижности выбирают р. Н буфера, БУФЕРНЫЕ СИСТЕМЫ. ВЫБОР КОНЦЕНТРАЦИИ ГЕЛЯ. Для обеспечения хорошей электрофоретической подвижности выбирают р. Н буфера, отличающийся на 3— 4 единицы от среднего значения р. I для белков данного типа. Для кислых белков часто используют буфер с р. Н 8, 9, для основных — с р. Н 4 — 4, 5. Слабощелочные буферы: трис-HCl, трисбуферы глициновый, трис-боратный или трисбарбитуратный ( для кислых белков!) Кислые буферы: К-ацетатный и трисацетатный буферы, а иногда, если белок это выдерживает, то и просто уксусную кислоту в концентрации 0, 9 М или 5% (0, 9 М СН 3 СООН имеет р. Н 2, 4; 0, 1 М—р. Н 2, 87 (для основных белков!) Подбор оптимальных условий электрофореза сводится к выбору следующих параметров: пористости геля и степени его сшивки, т. е. значений Т и С

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ БЕЛКА Rf - относительная электрофоретическая подвижность - отношение Электрофорез набора белков ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ БЕЛКА Rf - относительная электрофоретическая подвижность - отношение Электрофорез набора белков «маркеров» : расстояния, пройденного белковой полосой от начала рабочего геля, к аналогичному расстоянию до полосы красителя в этом же геле.

ДЕТЕКЦИЯ БЕЛКОВЫХ ЗОН Для визуализации результатов электрофореза белков чаще всего используют окрашивание гелей красителем ДЕТЕКЦИЯ БЕЛКОВЫХ ЗОН Для визуализации результатов электрофореза белков чаще всего используют окрашивание гелей красителем Кумасси или серебром. Для детекции белков, обладающих ферментативной активностью используют специфичные цветные реакции с соответствующим субстратом 1. Coomassie Brilliant Blue (неполярный сульфонированный трифенилметан): электростатическое взаимодействие с амино группами белков. 2. Окрашивание серебром взаимодействие катиона серебра с амино группами (Lys) и остатками серы (Cys, Met).

Электроперенос белков с ПААГ на мембрану (Электроблоттинг). Блоттинг, блоттинговый перенос (blotting or blot transfer) Электроперенос белков с ПААГ на мембрану (Электроблоттинг). Блоттинг, блоттинговый перенос (blotting or blot transfer) – процедура переноса электрофоретически разделенных полипептидов, белков, фрагментов ДНК или РНК с геля на бумагу или мембрану. Обычно используются 3 варианта блоттинга: Ø Капиллярный блоттинг - перенос молекул при помощи капиллярных сил. Ø Электроблоттинг - перенос молекул в электрическом поле. Ø Вакуумный блоттинг – перенос молекул с использованием неглубокого вакуума. Электрофорез в ПААГ белков маркеров молекулярных масс. Электроблоттинг нитроцеллюзную мембрану. на

ПРИНЦИП МЕТОДА. 1. Электрофорез белков в ПААГ. 2. Перенос белков с ПААГ на мембрану ПРИНЦИП МЕТОДА. 1. Электрофорез белков в ПААГ. 2. Перенос белков с ПААГ на мембрану под действием электрического тока.

МЕМБРАНЫ ДЛЯ БЛОТТИНГА. Иммобилизация белка на мембране основана на электростатических взаимодействиях между полярными группами МЕМБРАНЫ ДЛЯ БЛОТТИНГА. Иммобилизация белка на мембране основана на электростатических взаимодействиях между полярными группами материала мембраны и белком. Нитроцеллюлозная мембрана Связывает до 80 -100 мкг/см 2 белка Нейлоновая мембрана Позволяет обнаруживать следовые количества белка (480 мкг/см 2) Используется для Саузерн и Нозерн блоттинга Поливинилидендифторидная мембрана Способна удерживать до 160 мкг/см 2 белка; Многократное использование. Оптимальна для Вестерн блоттинга небольших белков, дот/слот блотов, секвенирования белков, аминокислотного анализа, аминокислотного и липополисахаридного анализа.

СПОСОБЫ ДЕТЕКЦИИ БЕЛКОВ НА МЕМБРАНЕ. Способ окраски * NC N P Окрашивание Ponceau S СПОСОБЫ ДЕТЕКЦИИ БЕЛКОВ НА МЕМБРАНЕ. Способ окраски * NC N P Окрашивание Ponceau S 1 -2µg + - + обратимое Amido Black 1. 5µg + - + постоянное, низкий фон Comassie blue 1. 5µg + - + постоянное, высокий фон India ink 100 ng + - + постоянное Biotin-avidin 30 ng + + + постоянное, бледнеет со временем + - + постоянное Colloidal gold 3 ng * - Чувствительность NC - Нитроцеллюлоза N - Нейлон P - PVDF лишь окрашивание Ponceau S обратимо и полностью совместимо с со всеми методами иммуноокрашивания При Вестерн Блоттинге детекцию определенных белковых зон на мембране проводят за счет специфичного взаимодействия с меченными антителами.

ТИПЫ ЭЛЕКТРОБЛОТТИНГА «Влажный перенос» (wet-blotting, tank-blotting) ØПроисходит в вертикальных резервуарах, содержащих буферные растворы ; ТИПЫ ЭЛЕКТРОБЛОТТИНГА «Влажный перенос» (wet-blotting, tank-blotting) ØПроисходит в вертикальных резервуарах, содержащих буферные растворы ; ØШироко используется для переноса высокомолекулярных белков (>60 k. Da) и белков, трудных для блоттинга, например, ферментов; ØБлагодаря большому объему буфера (от 0, 5 л до 5 л) можно значительно увеличить время переноса(более 24 ч), т. е. проводить мягкий блоттинг очень больших белков. «Полусухой перенос» (semidry-blotting, fast-blotting) Проводится между двумя горизонтальными пластинами- электродами; Позволяет провести перенос быстро и равномерно; Используется небольшое количество буферного раствора; Может использоваться, для мягкого переноса белков с небольшим молекулярным весом и/или для эффективного переноса многокомпонентных смесей белков с широкой дисперсией молекулярных весов; Можно использовать буферные диск-системы, т. е. один катодный буфер и два различных анодных буфера.

СБОРКА МОДУЛЯ ДЛЯ ЭЛЕКТРОБЛОТТИНГА СБОРКА МОДУЛЯ ДЛЯ ЭЛЕКТРОБЛОТТИНГА

СИСТЕМА ГЕЛЬ-ДОКУМЕНТИРОВАНИЯ Система гель-документирования Gel Doc XR чрезвычайно проста в использовании и практически незаменима СИСТЕМА ГЕЛЬ-ДОКУМЕНТИРОВАНИЯ Система гель-документирования Gel Doc XR чрезвычайно проста в использовании и практически незаменима в тех случаях, когда требуются высокое разрешение или чувствительность при детекции хемилюминисцентных красителей или 2 -D гелей высокого разрешения. Система снабжена камерами высокого разрешения. Области применения систем гельдокументирования разнообразны: 1) Детекция нуклеиновых кислот; 2) Вестерн-блоттинг; 3) 2 -D электрофорез; 4) Дот-блоттинг; 5) Денситометрия; 6) Подсчет числа колоний; 7) Детекция хемилюминесценции. Chemi. Doc XR