ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ. ЧАСТЬ 3. Электроблоттинг
ПРИНЦИП ЭЛЕКТРОФОРЕЗА. Разделение биополимеров по Ø размерам (молекулярной массе), Øпространственной конфигурации, Øвторичной структуре, Øэлектрическому заряду.
ПРИНЦИП ЭЛЕКТРОФОРЕЗА. ПАРАМЕТРЫ ПРОЦЕССА. üИонный состав и ионная сила электрофоретических буферов üТемпература üЗначение р. Н буфера üНапряжение электрического тока üТип, пористость и вязкость неподвижной фазы (электрофоретического геля)
Подвижность макромолекул в полиакриламидном геле обратно пропорциональна среднему размеру пор (формула Фергюсона): Lg U = lg U 0 – Kr Т Kr – коэффициент задержки; U – подвижность макромолекул в геле; U 0 – подвижность макромолекул в свободном растворе; Т – плотность геля (концентрация мономеров)
SDS – ЭЛЕКТРОФОРЕЗ C 12 H 25 OSO 3 Na Фракционирование белков в зависимости от электрического заряда молекулы белка Фракционирование белков в зависимости от РАЗМЕРА белковой молекулы (от молекулярной массы)!
ПААГ характеризуется процентным содержанием мономеров (Т) и количеством сшивающего агента в процентах от общего количества мономеров (С): • a – количество акриламида в г; • b – количество сшивающего мономера в г; • m – количество буфера в мл. • Установлено, что при получении гелей для электрофореза необходимо соблюдать следующее правило: чем выше концентрация акриламида, тем ниже должна быть концентрация бисакриламида, и наоборот.
БУФЕРНЫЕ СИСТЕМЫ. ВЫБОР КОНЦЕНТРАЦИИ ГЕЛЯ. Для обеспечения хорошей электрофоретической подвижности выбирают р. Н буфера, отличающийся на 3— 4 единицы от среднего значения р. I для белков данного типа. Для кислых белков часто используют буфер с р. Н 8, 9, для основных — с р. Н 4 — 4, 5. Слабощелочные буферы: трис-HCl, трисбуферы глициновый, трис-боратный или трисбарбитуратный ( для кислых белков!) Кислые буферы: К-ацетатный и трисацетатный буферы, а иногда, если белок это выдерживает, то и просто уксусную кислоту в концентрации 0, 9 М или 5% (0, 9 М СН 3 СООН имеет р. Н 2, 4; 0, 1 М—р. Н 2, 87 (для основных белков!) Подбор оптимальных условий электрофореза сводится к выбору следующих параметров: пористости геля и степени его сшивки, т. е. значений Т и С
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ БЕЛКА Rf - относительная электрофоретическая подвижность - отношение Электрофорез набора белков «маркеров» : расстояния, пройденного белковой полосой от начала рабочего геля, к аналогичному расстоянию до полосы красителя в этом же геле.
ДЕТЕКЦИЯ БЕЛКОВЫХ ЗОН Для визуализации результатов электрофореза белков чаще всего используют окрашивание гелей красителем Кумасси или серебром. Для детекции белков, обладающих ферментативной активностью используют специфичные цветные реакции с соответствующим субстратом 1. Coomassie Brilliant Blue (неполярный сульфонированный трифенилметан): электростатическое взаимодействие с амино группами белков. 2. Окрашивание серебром взаимодействие катиона серебра с амино группами (Lys) и остатками серы (Cys, Met).
Электроперенос белков с ПААГ на мембрану (Электроблоттинг). Блоттинг, блоттинговый перенос (blotting or blot transfer) – процедура переноса электрофоретически разделенных полипептидов, белков, фрагментов ДНК или РНК с геля на бумагу или мембрану. Обычно используются 3 варианта блоттинга: Ø Капиллярный блоттинг - перенос молекул при помощи капиллярных сил. Ø Электроблоттинг - перенос молекул в электрическом поле. Ø Вакуумный блоттинг – перенос молекул с использованием неглубокого вакуума. Электрофорез в ПААГ белков маркеров молекулярных масс. Электроблоттинг нитроцеллюзную мембрану. на
ПРИНЦИП МЕТОДА. 1. Электрофорез белков в ПААГ. 2. Перенос белков с ПААГ на мембрану под действием электрического тока.
МЕМБРАНЫ ДЛЯ БЛОТТИНГА. Иммобилизация белка на мембране основана на электростатических взаимодействиях между полярными группами материала мембраны и белком. Нитроцеллюлозная мембрана Связывает до 80 -100 мкг/см 2 белка Нейлоновая мембрана Позволяет обнаруживать следовые количества белка (480 мкг/см 2) Используется для Саузерн и Нозерн блоттинга Поливинилидендифторидная мембрана Способна удерживать до 160 мкг/см 2 белка; Многократное использование. Оптимальна для Вестерн блоттинга небольших белков, дот/слот блотов, секвенирования белков, аминокислотного анализа, аминокислотного и липополисахаридного анализа.
СПОСОБЫ ДЕТЕКЦИИ БЕЛКОВ НА МЕМБРАНЕ. Способ окраски * NC N P Окрашивание Ponceau S 1 -2µg + - + обратимое Amido Black 1. 5µg + - + постоянное, низкий фон Comassie blue 1. 5µg + - + постоянное, высокий фон India ink 100 ng + - + постоянное Biotin-avidin 30 ng + + + постоянное, бледнеет со временем + - + постоянное Colloidal gold 3 ng * - Чувствительность NC - Нитроцеллюлоза N - Нейлон P - PVDF лишь окрашивание Ponceau S обратимо и полностью совместимо с со всеми методами иммуноокрашивания При Вестерн Блоттинге детекцию определенных белковых зон на мембране проводят за счет специфичного взаимодействия с меченными антителами.
ТИПЫ ЭЛЕКТРОБЛОТТИНГА «Влажный перенос» (wet-blotting, tank-blotting) ØПроисходит в вертикальных резервуарах, содержащих буферные растворы ; ØШироко используется для переноса высокомолекулярных белков (>60 k. Da) и белков, трудных для блоттинга, например, ферментов; ØБлагодаря большому объему буфера (от 0, 5 л до 5 л) можно значительно увеличить время переноса(более 24 ч), т. е. проводить мягкий блоттинг очень больших белков. «Полусухой перенос» (semidry-blotting, fast-blotting) Проводится между двумя горизонтальными пластинами- электродами; Позволяет провести перенос быстро и равномерно; Используется небольшое количество буферного раствора; Может использоваться, для мягкого переноса белков с небольшим молекулярным весом и/или для эффективного переноса многокомпонентных смесей белков с широкой дисперсией молекулярных весов; Можно использовать буферные диск-системы, т. е. один катодный буфер и два различных анодных буфера.
СБОРКА МОДУЛЯ ДЛЯ ЭЛЕКТРОБЛОТТИНГА
СИСТЕМА ГЕЛЬ-ДОКУМЕНТИРОВАНИЯ Система гель-документирования Gel Doc XR чрезвычайно проста в использовании и практически незаменима в тех случаях, когда требуются высокое разрешение или чувствительность при детекции хемилюминисцентных красителей или 2 -D гелей высокого разрешения. Система снабжена камерами высокого разрешения. Области применения систем гельдокументирования разнообразны: 1) Детекция нуклеиновых кислот; 2) Вестерн-блоттинг; 3) 2 -D электрофорез; 4) Дот-блоттинг; 5) Денситометрия; 6) Подсчет числа колоний; 7) Детекция хемилюминесценции. Chemi. Doc XR
Скачать презентацию ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ ЧАСТЬ 3 Электроблоттинг ПРИНЦИП
занятие3 ЭФ белков и элблоттинг.ppt