Физическая химия биополимеров Лаврик О. И. НГУ-2012
2. Комплексы биополимеров с лигандами. Специфические взаимодействия. Методы определения констант равновесия
Простейшая модель взаимодействия биополимера с лигандом (модель двух состояний) P+L kасс PL (P – полимер, L – лиганд, PL – комплекс) kдисс kасс – константа скорости ассоциации, [M]-1[t] -1 kдисс – константа скорости диссоциации, [t]-1 Касс = kасс/ kдисс термодинамическая константа ассоциации, [М]-1 Кдисс = 1/Касс = kдисс/ kасс термодинамическая константа диссоциации, [М] (Кдисс или КD характеризует сродство лиганда к полимеру)
![КD ? [P]? [L]? Pt=[P]+[PL] Lt=[L]+[PL]?](https://present5.com/presentation/-57762074_218703921/image-4.jpg "КD ? [P]? [L]? Pt=[P]+[PL] Lt=[L]+[PL]?")
КD ? [P]? [L]? Pt=[P]+[PL] Lt=[L]+[PL]?
Определение Касс в координатах Скечерда Lb (bound) – связанный в комплекс лиганд Lf (free) – свободный лиганд Касс= = Pt. Касс- Касс. Lb Если полимер имеет несколько одинаковых и невзаимодействующих центров связывания n (например, в случае, когда белок состоит из нескольких идентичных субъединиц): = n. Pt. Касс - Касс. Lb
При предельном количестве связанного лиганда (Lb∞) выражение можно записать в виде: = Касс(Lb∞ - Lb) Вместо величин Lb, Lb∞ можно использовать любое свойство системы, пропорциональное концентрации комплекса. В случае реакций, катализируемых ферментами (Е), процесс превращения лиганда-субстрата (S), происходит в комплексе фермент-субстрат (ES), и выражение для скорости превращения субстрата можно написать в виде: = Касс(v∞ - v) Если лиганд в избытке, то концентрация свободного лиганда равна полной концентрации лиганда Pt, и можно записать: = Касс(Lb∞ - Lb) или Lb=
![Методы определения констант равновесия • метод гель-фильтрации (t разделения [мин]), • метод задержки в](https://present5.com/presentation/-57762074_218703921/image-7.jpg "Методы определения констант равновесия • метод гель-фильтрации (t разделения [мин]), • метод задержки в")
Методы определения констант равновесия • метод гель-фильтрации (t разделения [мин]), • метод задержки в геле, • фильтрование через нитроцеллюлозные мембраны (миллипоровые фильтры) (t разделения [сек]).
Определение KD в случае, когда у свободного биополимера или лиганда какое-либо измеряемое физическое свойство (Ф) достаточно изменяется при комплексообразовании: комплексообразовании Для полимера: Ф = αРФР + αPLФPL Для лиганда: Ф = αLФL + αPLФPL где αР, αPL, αL – соответствующие мольные доли ФР или ФL находят измерением в отсутствие второго партнера. ФPL – находят путем измерения при избытке второго партнера: проводят серию измерений при возрастающей концентрации второго партнера до тех пор, пока зависимость измеряемой величины от концентрации этого партнера не выйдет на плато.
Если обозначить значение измеряемой величины в отсутствие второго партнера через Ф 0, а предельное значение через Ф∞, то для величины αPL нетрудно получить выражение: Ф - Ф 0 αPL = Ф∞ - Ф 0 Концентрация комплекса PL находится как: PtαPL, если измеряется характеристика полимера, LtαPL, если измеряется характеристика лиганда.
Методы определения констант равновесия Спектрофотометрические методы Закон Бугера-Ламберта-Бера А=εсl А – оптическая плотность (поглощение) раствора, ε – коэффициент экстинкции, с – концентрация вещества, l – оптический путь в растворе. Оптическая плотность А=lg(I 0/I) I 0 – интенсивность падающего света, I – интенсивность света, прошедшего через образец
Методы определения констант равновесия Метод спектрофлуорометрии
Методы определения констант равновесия Метод спектрофлуорометрии F – суммарная флуоресценция: F = FP + FPL FP – флуоресценция полимера, не связанного с лигандом, FPL – флуоресценция полимера, связанного в комплекс, FP 0=FP[P]+FPL(P 0 -[P]) [P]=P 0 Константа диссоциации: [PL]=P 0 Kd =
Определение констант равновесия на приборах Biacore, основанное на явлении поверхностного плазмонного резонанса (ППР) В ферментативной кинетике: определение концентраций участников реакции, изучение взаимодействия типов белок-белок, белокнизкомолекулярный лиганд и белок-нуклеиновая кислота. Достоинства метода • Позволяет исследовать быстро протекающие процессы, в частности кинетику ферментативных реакций • Не требует мечения реагентов химическими, флуоресцентными или радиоактивными метками. • Используется без сопряженных реакций или введения в систему дополнительных компонентов, облегчающих детекцию. • Для определения равновесных параметров взаимодействия биомолекул не требуется разделения свободных и связанных форм. • Позволяет работать с минимальным объемом образцов в пределах 10 мкл. • Часть образца, не связавшаяся с поверхностью, может быть собрана во время опыта и вновь использована в дальнейшем. • Связанные с детектором молекулярные комплексы можно анализировать соответствующими способами, например, масс-спектрометрическими методами.
Определение констант равновесия на приборах Biacore Принцип работы приборов Biacore Свет лазера фокусируется на сенсорной поверхности и связывание «аналита» (свободного партнера в растворе) регистрируется по изменению резонансного угла (эффект ППР).
Определение констант равновесия на приборах Biacore • Изучение функций белков, механизмов молекулярного узнавания; • Экспериментальная проверка компьютерных предсказаний межмолекулярных взаимодействий; • Селекция антител и аптамеров; • Скрининг прототипов лекарств и физиологически активных веществ; • Анализ маркеров заболеваний; • Определение следового количества гормонов, антибиотиков, анаболиков и др. ; • Анализ качества фармацевтических препаратов; • Разработка диагностических тест-систем; • Разработки вакцин.
Скачать презентацию Физическая химия биополимеров Лаврик О И НГУ-2012
physchem_biopol_2012_2.ppt