Физическая химия биополимеров Лаврик О И НГУ-2012

Физическая химия биополимеров Лаврик О. И. НГУ-2012

8. Группоспецифическая химическая модификация. Применение для исследования структуры и функции активных центров ферментов

Методы изучения структуры и функций биополимеров и активных центров ферментов Ø Рентгеноструктурный анализ (РСА) – основной на сегодняшний день метод исследования структуры ферментов, Ø Сайт-направленный мутагенез, мутагенез Ø Химическая модификация и ее более специфический тип – аффинная модификация, Ø Методы, основанные на применении флуоресцентных и спиновых меток

Подбор химических модифицирующих агентов 1. Высказывается предположение об аминокислотных остатках, находящихся в активном центре фермента или интересующем сайте, 2. Осуществляется подбор реагентов, специфичных к определенным аминокислотам, 3. Исследуется ковалентное присоединение реагента к белку и стехиометрия присоединения, 4. Определяется уровень инактивации фермента, как следствие химического воздействия. R R Схема химической модификации. Х – модифицируемый остаток аминокислоты в активном центре, R – химический реагент.

Недостаток метода Y R R R Y R

После реакции модификации: • Входит ли модифицированный аминокислотный остаток в активный центр фермента? • Важен ли он для активности фермента?

После реакции модификации: Анализ образовавшихся продуктов Гидролиз с помощью протеаз Идентификация модифицированного остатка: (разделение полученной смеси пептидов с помощью электрофореза или хроматографических методов) Двумерный электрофорез: анализируемый пептид вырезали из геля и секвенировали по Эдману Масс-спектрометрический метод MALDI и его различные разновидности

Влияние р. К функциональных групп биополимеров на их реакционную способность Изменение р. К боковых радикалов аминокислотных остатков вследствие их окружения в составе белков является одним из главных факторов, определяющих их реакционную способность. Например, большинство аминокислот реагируют в непротонированной форме, а значения р. К для фyнкциональных групп одинакового строения, в зависимости от их окружения в молекуле белка, могут отличаться на 2 единицы.

Модификация остатка серина протеаз, R=-СН 2 ОН Для модификации гистидина в активном центре протеаз: Br. CH 2 C(O)NH 2 Br. CH 2 COOH ICH 2 COOH Br-ацетамид Br-уксусная кислота I-уксусная кислота При р. Н 6 -7 модификации подвергался остаток Ser, хотя при таких значениях р. Н –ОН группы серина почти не гидролизуются. Cерин изначально проявляет слабую нуклеофильность. В растворе такая реакция не пойдет, а в активном центре нуклеофильность серина существенно повышается при помощи гистидина, оттягивающего на себя протон в паре Ser-His

Модификация остатка цистеина I-уксусная кислота

Модификация остатка лизина 1 -фтор-2, 4 -динитробензол пиридоксаль-5’-фосфат

Модификация остатка аргинина с помощью фенилглиоксаля

Модификация остатка тирозина N-бромсукцинимид

Модификация остатка гистидина диэтилпирокарбонат

Модификация биополимеров бифункциональными реагентами Ø Реагенты, содержащие две модифицирующие группировки, способны присоединяться к двум сближенным группам в составе одного белка или молекулы нуклеиновой кислоты или образовывать ковалентные связи с двумя молекулами биополимеров. Ø Расстояние между функциональными группами, подвергающимися модификации одной молекулой реагента, ограничено его длиной. Поэтому исследование модификации с помощью бифyнкциональных реагентов различной длины позволяет получить информацию о взаимном расположении различных функциональных групп в составе биополимеров, макромолекул в сложных комплексах (рибосомы, хроматин) или в клеточных структурах (например, белки в мембранах) или даже об организации ферментных комплексов внутри живой клетки.

Бифyнкциональные реагенты Содержат две одинаковые реакционноспособные группы Модификация осуществляется простой обработкой исследуемого биополимера или макромолекулярного комплекса с помощью реагента Гетерофункциональные содержат две реакционноспособные группы различной специфичности Модификация осуществляется последовательно Реагент может быть сначала присоединен к одной из макромолекул. Затем после помещения биополимера в какие-то новые условия проводится модификация второй функциональной группой

Примеры бифункциональных реагентов диимидоэфиры 1, 5 -дифтор-2, 4 -динитро-бензол

Пример гетерофункциональных реагентов Реагенты содержат азидогруппы и группы, специфично модифицирующие аминогруппы или SH-гpyппы Первоначально можно присоединить эти реагенты к определенным точкам в структуре белка за счет светонезависимых специфичных реакций. Затем может быть проведена активация азидогрyпп реагента. При этом будут происходить реакции в окрестности модифицированной аминогрyппы или SH –группы.

Расщепляемые бифyнкциональные реагенты Содержат между реакционноспособными группами специальную структуру, которая позволяет расщепить реагент на две части после проведения модификации. В качестве таких структур используют, например, дисульфидную связь, которая может быть разрушена окислением или восстановлением: Или цис-гликольную группировку, которую можно разрушить окислением перйодатом. При модификации диэпоксибутаном цисгликольная группировка возникает в реакции: