ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный технический

ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный технический университет» Методы введения рекомбинантных ДНК в клетки. Кальций-фосфатный метод. Подготовила студентка гр. ДРЭ-41: Невалённая А. А.

Кальций-фосфатный метод введения генов был впервые описан в работе Давидсона и в настоящее время используется наиболее широко. Он применяется для введения любой ДНК в клетки. 2

Экзогенную ДНК смешивают с хлористым кальцием и затем добавляют к раствору, содержащему фосфатные ионы. В результате происходит соосождение ДНК с фосфатом кальция, образующийся осадок легко проникает в культивируемые клетки, и затем происходит эффективная экспрессия экзогенного гена. + =

В качестве донора можно использовать ДНК любого происхождения, если в ней присутствуют регулярные последовательности, необходимые для экспрессии генов в клетках. Чаще всего в качестве ДНК-носителя в экспериментах используют ДНК тимуса телёнка. 4

Наилучшие результаты в опытах по трансформации всегда получают на реципиентных клетках, находящихся в экспоненциальной фазе роста. В начале в опытах по трансформации использовали довольно небольшие времена абсорбции - 0, 5 -4 ч. Однако, анализ показал, что наиболее высокая эффективность трансформации достигается при более длительной (до 24 ч) инкубации реципиентных клеток с суспензией. О результате опытов судят по изменению фенотипа клеток. Уровень генной экспрессии зависит от количества донорной ДНК, используемой для трансфекциик клеток. Известно несколько химических «усилителей» экспрессии донорной ДНК. «Усилитель» обычно добавляют через 4 -8 ч после абсорбции ДНК-фосфат кальция. «Усилители» : ДМСО, глицерол, колкицин, колцемид, колхицин+ и т. д. 5

Для повышения эффективности трансформации к специфической ДНК, содержащей ген, по которому будет производится селекция, добавляется неспецифическая ДНК- носитель. Часть ДНК связывается с мембраной и не попадает в клетки. ДНК акцептируют от 15 до 90% клеток. Через несколько суток после введения небольшая доля клеток способны экспрессировать чужеродные гены, но затем уровень экспрессии падает и более или менее стабильную трансформацию претерпевает достаточно малое количество клеток. 6

На примере ДНК вируса простого герпеса показано, что сразу после соосаждения с фосфатом кальция вирусная ДНК становится устойчивой к разрушению ультразвуком, но комплекс фосфат кальция – ДНК остается чувствительным к ДНКазе в течение 4 ч. При взаимодействии этого комплекса с культурой клеток животных ДНК становится устойчивой к ДНКазе уже в течение первого часа. ДНК образует с фосфатом кальция прочный комплекс, который при оптимальных условиях поглощают практически все реципиентные клетки. 7

Эффективность поглощения клетками комплекса фосфат кальция – ДНК в значительной степени зависит от р. Н, при котором формировался этот комплекс, и концентрации ДНК. Важно, чтобы осадок фосфата кальция получился мелкодисперсным. Но даже в оптимальных условиях проведения трансфекции данным методом лишь в 1 -5 % клеток комплекс достигает ядра. По-видимому, проникновение ДНК из цитоплазмы в ядро является критическим этапом, наиболее сильно влияющим на эффективность трансфекции клеток вирусной ДНК. 8

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!!!