ФГАОУ ВО Крымский федеральный университет имени В И

ФГАОУ ВО Крымский федеральный университет имени В. И. Вернадского Медицинская академия имени С. И. Георгиевского Культивирование в лабораторных условиях вируса Зика Подготовила: Студентка 203 -с группы Муравьева Екатерина Сергеевна

— вид вирусов рода Flavivirus (семейство Flaviviridae), переносимый комарами рода Aedes. Flavivirus — род арбовирусов, относящийся к семейству Flaviviridae. При укусе заражённого комара или клеща могут передаваться человеку, вызывая заболевания различной тяжести, варьирующей от бессимптомного протекания до угрожающих жизни геморрагических лихорадок и энцефалитов (лихорадка денге, лихорадка Зика, клещевой энцефалит, японский энцефалит.

Вирус Зика — инфекция, которую разносят комары Aedes aegypti, или так называемый египетский комар. В начале 50 -х годов прошлого века это заболевание было впервые зафиксировано у человека. Однако никакой паники в медицинском сообществе не возникло, так как за 60 лет было всего 15 пострадавших. Первая крупная вспышка инфекции произошла в 2007 году на острове Яп в Тихом океане, в 2013 — во Французской Полинезии, а в 2015 году — в Бразилии. Свое название вирус получил в честь леса Зика в Уганде, где он и был впервые обнаружен. На территории Бразилии уже более 1 миллиона заболевших, а с октября там было зафиксировано 4 тысячи новорожденных с микроцефалией. Еще 20 тысяч человек заражены в Колумбии. Все больше больных появляется в Венесуэле, Мексике и Гватемале. В общей сложности инфекция проникла как минимум в 23 страны и вышла за пределы Латинской Америки. Вспышки уже были зарегистрированы в Азии и Африке, сообщалось о заболевших в США и Европе.

Культивирование и репродукция • В качестве исследуемого материала используют: Ø сыворотку крови (в первые три дня появления симптомов) Ø слюну или мочу (в течение первых 3 -10 дней с момента проявления симптоматики)

Культивирование и репродукция • Рекомендуемая среда для культивирования вируса Зика – клетки Vero , культивируемые в среде MEM с 2 % фетальной бычьей сывороткой.

Культивирование и репродукция • Минимальная эссенциальная среда (МЕМ), разработанный Гарри Eagle, является синтетической средой для культивирования клеток. Она включает в себя более высокие концентрации аминокислот, так что среда приближается к белковому составу клеток млекопитающих. Была дополнительно модифицирована путем элиминации кальция, для обеспечения роста клеток в суспензии.

Культивирование и репродукция • Полученных из почки африканской зеленой мартышки в 1960 -е годы, Vero клетки чувствительны к широкому диапазону вирусов, включая вакцины против кори, эпидемического паротита, краснухи, и многие членистоногими вирусы. Клетки Vero обычно используются в вирусологических лабораториях для получения вирусной культуры.

Культивирование и репродукция • Рекомендации для культивирования: • Удаляют среду и затем промывают монослой с PBS или в бессывороточной среде перед посевом. Инокулируют с небольшим объемом посевного материала ( например, 1 мл на 25 см 2). Адсорбируют в течение 1 часа при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% СО 2. Завершают адсорбцию путем добавления среды для выращивания вируса. Инкубация : 3 -5 дней при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% СО 2 , пока ЦПД не прогрессирует через 80 -90% монослоя.

Культивирование и репродукция • Для выделения вируса исследуемым материалом (неразведенным и в разведениях 1: 16 и 1: 50) также заражают белых мышей, куриные эмбрионы, культуры клеток (Vero клетки).

Культивирование и репродукция • Мышей заражают в мозг (0, 01 – 0, 02 мл), внутрибрюшинно (0, 05 мл) или подкожно (0, 03 мл). Затем животных наблюдают в течение 2 -3 недель, заболевших особей забивают и исследуют 10% суспензию мозга. Животных, погибших в течение 1 -3 дней после заражения, не учитывают.

Культивирование и репродукция • Для выделения вирусов используют первичные культуры клеток: - Куриные и утиные фибробласты - Клетки почек эмбриона свиньи - Культуры тканей членистоногих (комаров)

Культивирование и репродукция • Куриные эмбрионы заражают в тело, амнион, желточный мешок, на ХАО. Индикацию вирусов проводят в реакции гемагглютинации, по цитопатическому действию, образованию бляшек, гибели мышей, куриных эмбрионов. Для РГА обычно используют гусиные эритроциты.

• Вирус Зика в клетках человеческой кожи. • (Электронно-микроскопическое визуализация ZIKV -инфицированных первичных фибробластов). • A - мембранные везикулы с размерами от 70 до 100 нм, наблюдаемые в тесной связи с ЭПС, обозначены белой стрелкой . Черные стрелки указывают на наличие сферических капсид обнаруженных в внутриклеточных вакуолях. • B - в увеличенном масштабе ZIKV частицы . Внутриклеточная электрон- плотный сферический капсид составляет 40 нм в диаметре. • C - в собранном виде капсиды транспортируются к клеточной поверхности в внутриклеточных вакуолях. • D - автофагосомы часто обнаруживаются в инфицированных фибробластах , и собранные капсиды наблюдаются внутри этого отсека.

Культивирование и репродукция • Основные диагностические методы: обнаружение нуклеиновых кислот в сыворотке крови, а также в слюне или моче – используя обратную транскриптазполимеразную цепную реакцию (ПЦР). • Серологические тесты, включая иммунофлюоресцентное и иммуноферментное исследование крови, могут указать на наличие антител Ig. M и Ig. G.

Культивирование и репродукция • Дифференциальная диагностика должна учитывать значительное сходство лихорадки Зика с другими инфекционными заболеваниями, развивающимися вследствие укусов комаров в эндемичных регионах: • лихорадки Денге, • чикунгунья, • малярии.

Патентная заявка на кандидатную вакцину была подана 9 месяцев назад • Ученые из индийской корпорации Bharat Biotech заявили о том, что создали первую в мире вакцину от вируса Зика. По словам ученых, они создали два варианта вакцины, каждый из которых нуждается в проверке. • Как сообщили ВВС представители фармацевтической компании Inovio Pharmaceuticals, вакцина уже испытывалась на некрупных животных, теперь ее планируется протестировать на приматах, а во второй половине года начать испытания на людях.

Прогноз относительно распространения данной инфекции малоутешительный. До 2007 года вирус Зика давал вспышки лихорадки в тропической Африке и в некоторых районах Юго-Восточной Азии, после чего он перекинулся на некоторые острова Тихоокеанского региона. В апреле 2015 году данный вирус был впервые зарегистрирован в Южной Америке. Лихорадка Зика рассматривается как интенсивно распространяющееся инфекционное заболевание: его распространение отмечено в Бразилии, Чили, Колумбии, Сальвадоре, Гватемале, Мексике, Парагвае и Венесуэле.

Благодарю за внимание!