Ферменты генетической инженерии высокоспецифичные бактериальные ферменты-эндонуклеазы Ферменты-эндонуклеазы

Ферменты генетической инженерии высокоспецифичные бактериальные ферменты-эндонуклеазы

Ферменты-эндонуклеазы: I. Используемые для получения фрагментов ДНК (рестриктазы класса II); II. Соединяющие фрагменты ДНК (ДНК-лигазы); III. Синтезирующие фрагменты ДНК (ДНКполимеразы, обратная транскриптаза); IV. Позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК (терминальные трансферазы).

I. Рестрикцирующие эндонуклеазы (рестриктазы) Рестриктазы II класса высокоспецифичные бактериальные ферменты, которые узнают определенные последовательности оснований в молекуле ДНК и расщепляют обе цепи ДНК.

1962 г. В. Арбер : В бактериях действуют специальные ферменты, способные специфично отличать свою (бактериальную) ДНК от чужой (фаговой). Естественная функция рестриктаз – защита бактерии от инфекции вирусами: ферменты ограничивают возможность размножения фаговой ДНК в бактериях путем специфичной деградации. Описано около 2500 рестриктаз трех классов, выделенных из разных микроорганизмов.

Рестриктазы класса II Способны разрушить обе цепи чужеродной ДНК. С их помощью получают фрагменты ДНК воспроизводимого состава и длины.

Выделена первая рестриктаза класса II из штамма Haemofilus influencae Д. Натанс Х. Смит 1970 Название рестриктазы складывается из трех букв: Ø род микроорганизма обозначается прописной буквой, Ø вид — двумя строчными, (например, фермент из Haemofilus influencae — Hin). Ø типовая или штаммовая идентификация следует за родовидовой; Ø римские цифры — порядковый номер данной эндонуклеазы в ряду прочих рестриктаз, выделенных из данного микроорганизма. (например, Есо. RI или Hind. II) и т. д.

Сайт узнавания q Специфическая палиндромная последовательность из четырех - шести пар нуклеотидов в молекуле ДНК (палиндромная - последовательность-перевертыш, идентичная в обеих цепях при прочтении в направлении 5’ 3’) q для каждого конкретного фермента различается по длине, первичной структуре и способу разрыва молекулы ДНК). • При разрыве образуется серия фрагментов (рестриктов), с липкими или тупыми концами.

Рестрикты с липкими концами (Eco. RI, Bam. HI) Рестрикты, образовавшиеся при разрыве в двух цепях ДНК со смещением на несколько нуклеотидов и имеющие на концах короткие одноцепочечные участки ( «хвосты» ) , называются рестрикционными фрагментами с липкими концами.

Сайт узнавания рестриктазы Eco. RI «узнает» специфическую палиндромную последовательность из шести пар нуклеотидов и вносит разрыв между остатками гуанина и аденина в каждой цепи, Разрывы в цепи ДНК располагаются наискось друг от друга, в результате чего образуются рестрикционные фрагменты с липкими концами.

Рестрикты с тупыми концами (Hae. III) Рестрикты, образовавшиеся при разрыве в двух цепях ДНК без смещения называются рестрикционными фрагментами с тупыми концами.

Нуклеотидные последовательности, распознаваемые некоторыми рестриктазами Фермент Сайт узнавания Характер образуемых концов Eco. RI G↓-A - A-T- T - C C -T -T- A -A-↑G Выступающие концы с 5’-фосфатной группой Bam. HI G↓-G - A-T- C C -C -T- A -G-↑G Выступающие концы с 5’-фосфатной группой Hpa. I G - T- T↓ - A - C C - A -A↑ - T – T - G Тупые концы

Расщепление фрагмента ДНК рестриктазой Eco. RI c образованием липких концов S – дезоксирибоза, Р – фосфатная группа, ОН – гидроксильная группа, стрелки – связи, по которым происходит расщепление в сахарофосфатном остове; Сайт рестрикции выделен штриховой линией; Каждый одноцепочечный «хвост» заканчивается 5'-фосфатной группой, а З'-гидроксильная группа противоположной цепи как бы утоплена.

Расщепление фрагмента ДНК рестриктазой Hind. II с образованием тупых концов Последовательность, распознаваемая рестриктазой Hind. II, выделена штриховой линией

Нобелевская премия по физиологии и медицине 1978 год В. Арбер Werner Arber Д. Натанс Daniel Nathans Х. Смит Hamilton Smith за открытие ферментов рестрикции и их применение в молекулярной генетике

Применение рестриктаз: Образование новых комбинаций генов - рекомбинантных ДНК

II. ДНК-лигазы Катализаторы образования фосфодиэфирных связей между концами полинуклеотидных цепей, которые удерживаются благодаря спариванию липких концов

II. ДНК-лигазы Функция: Устранение разрыва в сахарфосфатном остове молекулы, восстановление связи между З’ОН концевой группой одной цепи и 5'фосфатной группой другой. Наиболее изучены ДНК-лигазы клеток E. coli и фага Т 4.

III. Полимеразы ДНК-полимераза I E. coli (обладает тремя видами активности)

1. Полимеразная активность ДНК-полимеразы I E. coli Cинтез цепи ДНК в направлении 5’ 3’. Осуществляется на однонитевой матрице присоединением нуклеотидных остатков к 3'ОНконцу комплементарной нити, являющейся в таком случае праймером: 5’-NNNNN-3' 3’-NNNNNNNN-5 ’ ↓ 5’-NNNNN -3' 3’-NNNNNNNN-5’

2. Экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы I E. coli в направлении 5’ 3’ Отщепление нуклеотидов с 5’-концов двунитевых молекул ДНК, что приводит к их деградации: 5'-NNNNNNNN-3’ 3’-NNNNNNNN-5 ’ ↓ 5’-NNNNN-3’ 3’ -NNNNN-5’

III. Экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы I E. coli в направлении 3’ 5’ Отщепление нуклеотидов с 3’ОН-концов одно- и двунитевых молекул ДНК 5'-NNNNNNNN-3’ 3’-NNNNNNNN-5 ’ ↓ 5'-NNNNN-3’ 3’-NNNNN-5 ’

Кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I Ø Ø Фрагмент ДНК-полимеразы I, который сохраняет только: полимеразную и 3’ 5’ экзонуклеазную активности (фрагмент отделен с помощью ферментов трипсина или субтилизина). Отсутствие в кленовском фрагменте 5’ 3’ экзонуклеазной активности позволяет: Ø использовать фермент для заполнения нуклеотидами выступающих однонитевых 5'-концов, образующихся при ступенчатом разрезании ДНК рестриктазами; Ø вводить радиоактивную метку, причем только в один конец ДНК, используя для этого подходящий меченый d. NТР.