ФЕРМЕНТАТИВНАЯ КИНЕТИКА Ферменты чрезвычайно эффективные катализаторы

Скачать презентацию ФЕРМЕНТАТИВНАЯ КИНЕТИКА Ферменты чрезвычайно эффективные катализаторы

lectures both.ppt

Количество слайдов: 147

ФЕРМЕНТАТИВНАЯ КИНЕТИКА

Ферменты – чрезвычайно эффективные катализаторы

$[ML] = [M 0][L]/(KD+ [L] Y = fractional saturation = ([ML]/[M 0] = [L]/(KD+$ [ML] = [M 0][L]/(KD+ [L] Y = fractional saturation = ([ML]/[M 0] = [L]/(KD+ [L]) K d = ([M][L])/[ML] = [Mo-ML][L])/[ML]

Протеазы: хромо/флуорогенные субстраты λmax = 410 nm (E 410 nm = 8800 M-1 cm-1)

β-галактозидаза о. -нитрофенол: λmax = 420 nm (E 410 nm = 4500 M-1 cm-1)

β-лактамаза

Протеазы: size-exclusion chromatography succinyl-Ala-Pro-Phe-4 -NA (A), D-Phe-Pip-Arg-4 -NA (B), and D-Ile-Pro-Arg-4 -NA (C).

Оксидоредуктазы: NAD(P)+→ NAD(P)H acetoacetate + NADP+ + Co. M → 2 -ketopropyl-Co. M + CO 2 + NADPH

Оксидоредуктазы: NAD(P)+→ NAD(P)H HPLC analysis ( , DQ; , Q 2; , DQH 2; , Q 2 H 2) UV–visible spectroscopy (+, NADH)

Cистемы сопряженных реакций I. II.

Металлоферменты: масс-спектрометрия

РНКазы: radiolabelling

Уравнение Михаэлиса-Ментен (1913 г. ) Леонор Михаэлис (1875 -1949) Мод Ментен (1879 -1960)

Уравнение Михаэлиса-Ментен Первоначальная схема Михаэлиса предусматривает: 1. Обязательное образование фермент-субстратного комплекса ( «комплекс Михаэлиса» ) 2. k 2<

Уравнение Михаэлиса-Ментен

Уравнение Михаэлиса-Ментен: стационарность (Бриггс, Холдейн, 1925 г. ) Современная интерпретация ур -ния ММ предусматривает следующие предположения: • Начальные скорости • Стационарное состояние • [S]>>[E]total

Уравнение Михаэлиса-Ментен: стационарность Скорость катализируемой реакции Скорость образования ES Скорость распада ES

Уравнение Михаэлиса-Ментен: физический смысл параметров Vmax и Km

Уравнение Михаэлиса-Ментен: физический смысл параметров Vmax и Km Vmax = kcat [E]total

kcat – «число оборотов»

Скорость-лимитирующая стадия: kcat – константа скорости СЛС

(Кинезин)

Линеаризация уравнения Михаэлиса-Ментен. 1. Преобразование Лайнуивера-Берка (1934 г. )

Линеаризация уравнения Михаэлиса-Ментен. 2. Преобразование Иди-Хофсти

Параметр

Не-Михаэлисовская кинетика: I. кооперативность связывания субстрата в активных центрах

Не-Михаэлисовская кинетика: I. кооперативность связывания субстрата в активных центрах h = Hill coefficient

Не-Михаэлисовская кинетика: I. кооперативность связывания субстрата в активных центрах

Не-Михаэлисовская кинетика: II. Аллостерические эффекты субстрата

Не-Михаэлисовская кинетика

Не-Михаэлисовская кинетика Схема II Активный центр аллостерический центр

Не-Михаэлисовская кинетика Polynomial Scheme I coefficient Scheme III 1 A Scheme II 1 KS KS B C D E K 1

Не-Михаэлисовская кинетика

Не-Михаэлисовская кинетика Parameter Scheme III Low substrate concentrations slope a 1 Y-intercept b 1 High substrate concentration slope a 2 Y-intercept b 2

Pre-steady-state kinetics

Титрование активных центров π π = [E]0 при [S]0>>Km(app) и k. I>>k. II Химотрипсин: циннамоил-имидазол, k. I = 1. 2 x 104 M-1 s-1 , k. II = 1. 3 x 10 -2 s-1. (Ref. JACS 88, 5890, 1966. )

Cellobiohydrolase

Мethylmalonate semialdehyde dehydrogenase

Мethylmalonate semialdehyde dehydrogenase Прединкубация с NAD Без прединкубации

Мethylmalonate semialdehyde dehydrogenase

Кинетика одного оборота

p. H Optima Enzyme in stomach Enzyme in liver Enzyme in mouth

Examples of p. H Optima Enzyme Lipase (pancreas) Lipase (stomach) Pepsin (stomach) Trypsin (intestine) Invertase (bacterial) Sucrase (intestinal) Urease p. H Optimum 8. 0 4. 0 – 5. 0 1. 5 – 1. 6 7. 8 – 8. 7 3. 5 – 5. 5 6. 5 7. 0

How p. H Changes Affect Enzymes • May alter the binding of S to E (affects KM) • May alter the catalysis of bound S (affects kcat or Vmax) – Side chains necessary to catalysis must be in correct protonation state • May alter global protein conformation • May alter protonation state of substrate • May alter spectral properties of product

Колоколообразные р. Н-зависимости.

р. Н-профили kcat или Vmax а) титруется 1 группа, активная форма ЕS (группа непротонир. ) б) титруются 2 группы, активная форма ЕSН (1 -я непротонир. , 2 -я протонир. ) ЕSН kcat ЕSН 2 ЕS в) титруется 1 группа, активная форма ЕSН (группа протонир. ) ЕSН ЕS

р. Н-профили kcat/Km или Vmax/Km а) титруется 1 группа, активная форма Е (группа непротонир. ) ЕН б) титруются 2 группы, активная форма ЕН (1 -я непротонир. , 2 -я протонир. ) в) титруется 1 группа, активная форма ЕН (группа протонир. ) ЕН 2 Е Е ЕН ЕН Е

Пример: химотрипсин

Базовая схема р. Н-зависимости кинетических параметров. * Связывание S тоже может зависеть от его р. Н-формы в Km и kcat/Km включается fs

Пример вывода уравнения р. Н-зависимости (пенициллаза).

Определение р. Ка методом Диксона (-Уэбба).

Максимальное vs р. Н-независимое значение параметра.

Отнесение констант ионизации. Cys 25 deprotonated His 159 protonated -H+ Deprotonation Protein denatured at p. H extremes

Типичные значения р. Ка групп белков (используемые по умолчанию в расчетных программах). Amino Acid Asp Glu Arg p. Ka 3. 0 - 4. 7 (4. 0) 3. 0 – 4. 7 (4. 4) 11. 6 – 12. 6 (12. 0) Lys His Cys(-SH) Tyr 7. 6 – 10. 6 (9. 0) 5. 6 – 7. 0 (6. 08) 8. 3 – 8. 6 (8. 28) 9. 8 – 10. 4 (9. 84)

Нетипичные значения р. Ка белковых групп. Ionizable groups are frequently in a more hydrophobic environment within the protein and are often involved in concerted hydrogen bonding networks Observed p. Ka affected by local environment

Влияние температуры на скорость ферментативных реакций

Ингибирование: 1. Необратимое ингибирование

Ингибирование: 1. Необратимое ингибирование DIFP (ацилирование Ser в АХэстеразе)

Ингибирование: 1. Необратимое ингибирование ингибиторы АХэстеразы зарин табун зоман VX

Ингибирование: 1. Необратимое ингибирование Аспирин (ацилирование Ser 530 в циклооксигеназе)

Ингибирование: 1. Необратимое ингибирование V = V 0 exp(-kinact t)

Ингибирование: 1. Необратимое ингибирование Зависимость 1/kapp от 1/[I]

Суицидальные ингибиторы пенициллин DD-транспептидаза Dead-end комплекс Е-I Клеточная стенка бактерий

Прочно связанные ингибиторы Барстар / барназа

Ингибирование: 2. Обратимое ингибирование

Конкурентное ингибирование S и I конкурируют за место связывания на ферменте Km , Vmax=const

Конкурентное ингибирование Субстратоподобные ингибиторы

Конкурентное ингибирование Sildenafil / c. GMP-specific phosphodiesterase type 5

Конкурентное ингибирование

Неконкурентное ингибирование S и I связываются в разных местах, но ингибитор снижает скорость реакции Vmax , Km=const

Неконкурентное ингибирование ATP / ФФК-1

Неконкурентное ингибирование

Бесконкурентное ингибирование S и I связываются в разных местах, но I связывается только после того, как S уже связался Vmax , Km пропорционально

Бесконкурентное ингибирование

Смешанное ингибирование

Ингибирование: 2. Обратимое ингибирование

Определение констант(ы) ингибирования I. Построение вторичных зависимостей Конкурентное ингибирование tg α в графике Лайнуивера-Берка Линейная зависимость tg α от [I], из которой и определяют Ki

Определение констант(ы) ингибирования I. Построение вторичных зависимостей Отрезок, отсекаемый Неконкурентное ингибирование на оси OY графике Лайнуивера-Берка Линейная зависимость отрезка от [I], из которой и определяют Ki 1) Для неконкурентного или бесконкурентного инг-ния строят вторичную зависимость отрезка, отсекаемого на оси OY (= 1/Vmax), от [I]. Константу Ki определяют из параметров получающейся прямой. 2) Для смешанного инг-ния из вторичной завис-ти tgα от [I] определяют Ki, а из завис-ти 1/Vmax от [I] – константу K’i.

Определение констант(ы) ингибирования I. Построение вторичных зависимостей

1/v Определение констант(ы) ингибирования II. Преобразование Диксона Ki [I]

Смешанное инг-ние

Для тренировки

Drug design Random selection rational

Двухсубстратные реакции

Примеры двухсубстратных реакций/ферментов glutathione S-transferase, [19] dihydrofolate reductase[20] DNA polymerase. [21] thioredoxin peroxidase, [22] acylneuraminate cytydilyltransferase[23], trypsin and chymotrypsin. [24]

Реакции с образованием тройного комплекса

Bacteriophage T 4 Dam DNA-[N 6 -adenine]Methyltransferase kmeth = 0. 56 s 1 kcat = 0. 015 s 1

Alternative schemes for T 4 Dam methylation of the 20 -mer DNA duplex Evdokimov, A. A. et al. J. Biol. Chem. 2002; 277: 279 -286

Глутатион-S-трансфераза GS-DNP product

Galactose mutarotase DIP-360 digital polarimeter: The change in a specific rotation of each substrate was measured as the alfa -anomer was converted to the equilibrium mixture of isomers

Rectangular hyperbolic plot (h = Hill coefficient) where h = 1 for a MM enzyme Hill plot Double-reciprocal plot where h = 1 for a MM enzyme Scatchard plot r/[S]h = (1/Kmh)(n-r) where h = 1 for a MM enzyme where h = 1 for a MM enzyme

Линеаризация уравнения Михаэлиса-Ментен. 3. Преобразование Хейнса-Вольфа

$Y = fractional saturation = Y = ([ML]/[M 0] = [L]/(KD+ [L]) [ML] =$ Y = fractional saturation = Y = ([ML]/[M 0] = [L]/(KD+ [L]) [ML] = [M 0][L]/(KD+ [L]

$[ML] = [M 0][L]/(KD+ [L] Y = fractional saturation = ([ML]/[M 0] = [L]/(KD+$ [ML] = [M 0][L]/(KD+ [L] Y = fractional saturation = ([ML]/[M 0] = [L]/(KD+ [L])

1/Y = (Kd + L)/L = (Kd/L) + 1 y = mx + b, where y = 1/Y, m = Kd, x = 1/L, and b = 1.

Y/L = (1 -Y)/Kd = -Y/Kd + 1/Kd y = mx + b, where y = Y/L, x = Y, m = -1/Kd, and b = 1/Kd.