ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВСЕРОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЦЕНТР КАЧЕСТВА

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ВСЕРОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЦЕНТР КАЧЕСТВА И СТАНДАРТИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ И КОРМОВ» ФГБУ «ВГНКИ» Актуальные вопросы сертификации семени быков производителей. Докладчик: Зав. Отдела по контролю качества и стандартизации генетического материала и преператов применяемых при воспроизводстве животных к. б. н. доцент Борунова С. М.

РАЗРАБОТКА СОВРЕМЕННЫХ ТРЕБОВАНИЙ И ПРАВИЛ МОНИТОРИНГА КАЧЕСТВА СПЕРМЫ БЫКОВ ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ ПО ЭПИЗООТИЧЕСКИМ, ГЕНЕТИЧЕСКИМ И РЕПРОДУКТИВНЫМ ПАРАМЕТРАМ. Актуальным является модернизация и усовершенствование ветеринарносанитарных требований, которые должны содержать всю исчерпывающую информацию по проведению контроля и мониторинга качества спермы быков производителей по эпизоотическим, генетическим и репродуктивным параметрам. Методические указания по ветеринарно-санитарному контролю качества спермы быков-производителей отменены приказом Минсельхоза РФ № 71 от 28. 04. 2005 г. Постановлением Правительства РФ от 13. 11. 2010 г. № 906 «О внесении изменений в Постановление Правительства РФ от 01. 12. 2009 № 982 «Об утверждении единого перечня продукции, подлежащей обязательной сертификации, и единого перечня продукции, подтверждение соответствия которой осуществляется в форме принятий декларации о соответствии» сперма сельскохозяйственных животных была исключена из перечня продукции, подлежащей обязательному подтверждению соответствия.

РАЗРАБОТКА СОВРЕМЕННЫХ ТРЕБОВАНИЙ И ПРАВИЛ МОНИТОРИНГА КАЧЕСТВА СПЕРМЫ БЫКОВ ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ ПО ЭПИЗООТИЧЕСКИМ, ГЕНЕТИЧЕСКИМ И РЕПРОДУКТИВНЫМ ПАРАМЕТРАМ. Цель работы: Разработка комплекса мероприятий по контролю и мониторингу качества генетического материала, предназначенного для проведения искусственного осеменения продуктивных животных по эпизоотическим, генетическим и репродуктивным параметрам. q Отработать оптимальные условия проведения оценки качества спермы; q. Провести мониторинговые исследования молекулярно-генетическими методами, направленные на оценку частоты встречаемости возбудителей болезней в спермопродукциии; q Оптимизировать условия детектирования возбудителей инфекционных болезней в сперме КРС молекулярно-генетическими методами; q Разработать молекулярно-генетические методики идентификации мутаций, ассоциированных с наиболее распространенными наследственными патологиями КРС; q Подготовить методические указания по ветеринарно-санитарному контролю качества замороженной спермы быков-производителей.

РАЗРАБОТКА СОВРЕМЕННЫХ ТРЕБОВАНИЙ И ПРАВИЛ МОНИТОРИНГА КАЧЕСТВА СПЕРМЫ БЫКОВ ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ ПО ЭПИЗООТИЧЕСКИМ, ГЕНЕТИЧЕСКИМ И РЕПРОДУКТИВНЫМ ПАРАМЕТРАМ. Работа разделена на три подтемы: Ø Изучение морфофункциональных особенностей и биологических характеристик генетического материала КРС. Ø Выявление возбудителей инфекционных болезней животных в системе контроля племенных животных и племматериала продуктивных животных молекулярногенетическими методами. Ø Разработка молекулярно-генетических методик идентификации мутаций, ассоциированных с наиболее распространенными наследственными патологиями КРС.

РАЗРАБОТКА СОВРЕМЕННЫХ ТРЕБОВАНИЙ И ПРАВИЛ МОНИТОРИНГА КАЧЕСТВА СПЕРМЫ БЫКОВ ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ ПО ЭПИЗООТИЧЕСКИМ, ГЕНЕТИЧЕСКИМ И РЕПРОДУКТИВНЫМ ПАРАМЕТРАМ. Подтема 1. Изучение морфофункциональных особенностей и биологических характеристик генетического материала КРС. ØВ рамках НИР был проведен научный консилиум ФГБУ «ВГНКИ» в августе 2016 года под патронажем председателя ТК 148 заместителя директора по науке «ВИЖ им. Л. К. Эрнста» академика РАН Стрекозова Н. И. , а в сентябре в стенах института ВИЖ им. Л. К. Эрнста. В консилиуме активно принимали участие главные технологи, генетики и врачи племенных центров страны, а также представители института ВНИИплем. ØНа ГОСТ 26030 -15 в технический комитет Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии поступили замечания от племенных предприятий, требующих разъяснения и уточнения в установленном порядке через Госстандарт. ØИтогом консилиума стала совместная работа по созданию и формированию перечня предложений составленных на основании замечаний от племенных предприятий РФ.

РАЗРАБОТКА СОВРЕМЕННЫХ ТРЕБОВАНИЙ И ПРАВИЛ МОНИТОРИНГА КАЧЕСТВА СПЕРМЫ БЫКОВ ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ ПО ЭПИЗООТИЧЕСКИМ, ГЕНЕТИЧЕСКИМ И РЕПРОДУКТИВНЫМ ПАРАМЕТРАМ. Подтема 1. Изучение морфофункциональных особенностей и биологических характеристик генетического материала КРС. Пункт Трактовка ГОСТ 26030 -2015 Замечания Однородная, желтая или светло-желтая жидкость без посторонних примесей. Характеристика приведена для нативной спермы. цвет замороженной спермопродукции зависит от компонентов разбавителя и может иметь, согласно п. 4. 2 (…в соответствии с документами государства, принявшего данный стандарт) любой оттенок. Исключено примечание от 01. 12. 87 к ГОСТУ 26030 -83 Вернуть примечание от 01. 12. 87 к ГОСТУ 26030 -83 в сокращенной редакции « Допускается использовать сперму с подвижностью не ниже 3 баллов (30%) и количеством сперматозоидов с прямолинейнопоступательным движением не ниже 10 млн. для высокоценных быковпроизводителей признанных улучшателями по показателям продуктивности, а также для быков мясных пород. Каждую упаковочную единицу спермы маркируют с указанием предприятия изготовителя и его товарного знака (при наличии), наименования продукции, номера серии, клички и инвентарного номера быка, даты замораживания Длина соломинки стандартна и равна 13, 3+0, 1 см (возможен различный диаметр). Предписанный перечень информации на соломинку не поместится, либо он будет нечитабельным, следовательно, не будет иметь смысла. Более того дата изготовления пересекается с серийным номером. Стандартно на соломинке указывается название племпредприятия, кличка, номер и порода производителя, дата изготовления. Этого достаточно. Сперму, упакованную в канистры, пластиковые тубы, гоблеты или помещают в сосуды 4. 6. 4. соломинки Дьюара различной вместимости и конструкции… Соломинки также помещаются в тубы или пластиковые стаканы (гоблеты). Россыпью упаковывать соломинки в сосуд Дьюара категорически запрещается! 4. 3 4. 5. 2

РАЗРАБОТКА СОВРЕМЕННЫХ ТРЕБОВАНИЙ И ПРАВИЛ МОНИТОРИНГА КАЧЕСТВА СПЕРМЫ БЫКОВ ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ ПО ЭПИЗООТИЧЕСКИМ, ГЕНЕТИЧЕСКИМ И РЕПРОДУКТИВНЫМ ПАРАМЕТРАМ. Подтема 1. Изучение морфофункциональных особенностей и биологических характеристик генетического материала КРС. В результате проведенных исследований Ø Ø Ø § Разработана методика определения целостности акросомы сперматозоида при помощи красителя Диффквик Разработана методика подсчета индекса фрагментации ДНК хроматина сперматозоида Подготовлены и находятся на согласовании проекты методических указаний микробиологических исследований спермопродукции по следующим параметрам: микологическая экспертиза заморожено-оттаянной спермы (позволит идентифицировать не только быстрорастущие-плесневые грибы, но и медленно растущие виды (сохраняющие свою активность в условиях криоконсервации) с использованием современных селективных питательных сред)

РАЗРАБОТКА СОВРЕМЕННЫХ ТРЕБОВАНИЙ И ПРАВИЛ МОНИТОРИНГА КАЧЕСТВА СПЕРМЫ БЫКОВ ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ ПО ЭПИЗООТИЧЕСКИМ, ГЕНЕТИЧЕСКИМ И РЕПРОДУКТИВНЫМ ПАРАМЕТРАМ. Подтема 2. Выявление возбудителей инфекционных болезней животных в системе контроля племенных животных и племматериала продуктивных животных молекулярно -генетическими методами. Ø В 2016 году проведено изучение литературных научных данных, направленное на оценку частоты встречаемости возбудителей инфекционных болезней животных в сперме КРС, изучены вопросы, касающиеся диагностических наборов, представленных на рынке в РФ для выявления фрагментов генома возбудителей инфекционных болезней КРС методом ПЦР. Ø Собран биологический материал, начата работа по подбору оптимального метода выделения нуклеиновых кислот из стабилизированной спермы. Проводится исследование отечественной и импортной спермопродукции, направленное на выявление следующих возбудителей: - вирус инфекционного ринотрахеита КРС 1 и 4 типа; - микроорганизмы рода Chlamydia; - микроорганизмы рода Mycoplasma; - вирус лейкоза КРС; - микроорганизмы рода Campylobacter ; Ø На первом этапе показана высокая частота встречаемости микроорганизмов рода Mycoplasma в стабилизированной сперме как отечественного производства, так и поставляемой из других государств.

РАЗРАБОТКА СОВРЕМЕННЫХ ТРЕБОВАНИЙ И ПРАВИЛ МОНИТОРИНГА КАЧЕСТВА СПЕРМЫ БЫКОВ ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ ПО ЭПИЗООТИЧЕСКИМ, ГЕНЕТИЧЕСКИМ И РЕПРОДУКТИВНЫМ ПАРАМЕТРАМ. Подтема 2. Выявление возбудителей инфекционных болезней животных в системе контроля племенных животных и племматериала продуктивных животных молекулярно-генетическими методами. Задачи на 2017 год: Ø Продолжить исследование племматериала с использованием ПЦР наборов отечественных и зарубежных производителей, направленное на выявление следующих возбудителей: - Вирус болезни Шмалленберг, - Neospora caninum, - Микроорганизмы рода Leptospira, - LSDV (возбудитель нодулярного дерматита), - Вирус диареи КРС, - Histophilus somni, Ø Провести анализ полученных данных для последующих разработок методик выявления инфекционных агентов методом ПЦР и создания рекомендаций для проведения контроля и мониторинга качества спермы по эпизоотическим параметрам. Ø Создать схему лабораторной диагностики микоплазмоза путем внедрения обязательного и основного культурального метода и дополнительного применения методом ПЦР.

РАЗРАБОТКА СОВРЕМЕННЫХ ТРЕБОВАНИЙ И ПРАВИЛ МОНИТОРИНГА КАЧЕСТВА СПЕРМЫ БЫКОВ ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ ПО ЭПИЗООТИЧЕСКИМ, ГЕНЕТИЧЕСКИМ И РЕПРОДУКТИВНЫМ ПАРАМЕТРАМ. Подтема 3. Разработка молекулярно-генетических методик идентификации мутаций, ассоциированных с наиболее распространенными наследственными патологиями КРС. В 2016 году разработана и готовится к утверждению в ФГБУ ВГНКИ методика «Идентификация мутаций, ассоциированных с наследственными болезнями крупного рогатого скота голштинской породы, молекулярно-генетическими методами» Проведен анализ нуклеотидных последовательностей генов-мишеней для диагностики наследственных мутаций крупного рогатого скота: üбрахиспинального синдрома (BY), üсиндрома иммунодефицита (BLAD), üсиндрома сложной деформации позвоночника (CVM), üдефицита уридинмонофосфатсинтетазы (DUMPS), üдефицита холестерина (CDH), üдефицита аргининсукцинат синтетазы (CIT), üдефицита XI фактора свертывания крови (FXID).

РАЗРАБОТКА СОВРЕМЕННЫХ ТРЕБОВАНИЙ И ПРАВИЛ МОНИТОРИНГА КАЧЕСТВА СПЕРМЫ БЫКОВ ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ ПО ЭПИЗООТИЧЕСКИМ, ГЕНЕТИЧЕСКИМ И РЕПРОДУКТИВНЫМ ПАРАМЕТРАМ. Подтема 3. Разработка молекулярно-генетических методик идентификации мутаций, ассоциированных с наиболее распространенными наследственными патологиями КРС. Задачи на 2017 год: планируется разработка методик идентификации мутаций, ассоциированных с наиболее распространенными наследственными патологиями КРС пород. q. Сбор и обработка литературных данных. Анализ нуклеотидных последовательностей генов мишеней по публичным базам данных (Gen. Bank). q. Выбор праймеров, позволяющих амплифицировать фрагменты генома Bos taurus в области значимых мутаций породы бурая швицкая ØSDM (спинальная демиелинизация) ØSAA (синдром арахномелии и артрогрипоза) ØW (прогрессирующая дегенеративная миелоэнцефалопатия жвачных, Вивер) ØSMA (спинальная мышечная атрофия ) q. Выбор праймеров, позволяющих амплифицировать фрагменты генома Bos taurus в области значимых мутаций породы ангусская: Ø DD (дупликация развития) Ø NH (нейропатическая гидроцефалия) Ø M 1, DM (гипертрофия мускулатуры) Ø CA (контрактурная арахнодактилия) Ø AM (множественный артрогрипоз) Ø OS (остеопетроз) q Синтез ПЦР праймеров, праймеров для пиросеквенирования и биотинилированных ПЦР праймеров. q Оптимизация и валидация методик на генетическом материале репрезентативной выборки животных.

РАЗРАБОТКА СОВРЕМЕННЫХ ТРЕБОВАНИЙ И ПРАВИЛ МОНИТОРИНГА КАЧЕСТВА СПЕРМЫ БЫКОВ ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ ПО ЭПИЗООТИЧЕСКИМ, ГЕНЕТИЧЕСКИМ И РЕПРОДУКТИВНЫМ ПАРАМЕТРАМ. Подтема 1. Изучение морфофункциональных особенностей и биологических характеристик генетического материала КРС. Сотрудничество в рамках НИР Головной центр по искусственному осеменению с/х животных ФГБНУ «ВИЖ» им. Л. К. Эрнста ФГБУ «ВГНКИ» НИИ физикохимической биологии им. А. Н. Белозерского ФГБНУ «ВИЭВ» им. Я. Р. Коваленко Институт химической физики им. Н. Н. Семёнова РАН, г. Москва

РАЗРАБОТКА СОВРЕМЕННЫХ ТРЕБОВАНИЙ И ПРАВИЛ МОНИТОРИНГА КАЧЕСТВА СПЕРМЫ БЫКОВ ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ ПО ЭПИЗООТИЧЕСКИМ, ГЕНЕТИЧЕСКИМ И РЕПРОДУКТИВНЫМ ПАРАМЕТРАМ. Подтема 1. Изучение морфофункциональных особенностей и биологических характеристик генетического материала КРС. Рецензии Головной центр по искусственному осеменению с/х животных Национальный союз племенных организаций Методические рекомендации ФГБУ «ВГНКИ» ОАО «Московское» по племенной работе» Российская академия менеджмента в животноводстве На согласовании: МГАВМи. Б им. К. И. Скрябина

РАЗРАБОТКА СОВРЕМЕННЫХ ТРЕБОВАНИЙ И ПРАВИЛ МОНИТОРИНГА КАЧЕСТВА СПЕРМЫ БЫКОВ ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ ПО ЭПИЗООТИЧЕСКИМ, ГЕНЕТИЧЕСКИМ И РЕПРОДУКТИВНЫМ ПАРАМЕТРАМ. Подтема 1. Изучение морфофункциональных особенностей и биологических характеристик генетического материала КРС. Определение целостности акросомы сперматозоидов в замороженной сперме у животных-производителей ØСущность метода заключается в определении под микроскопом числа сперматозоидов с интактной или поврежденной акросомой. Целостность акросомы определяют с помощью дифференцированного окрашивания ØРезультат: сперматозоиды с интактной акросомой окрашиваются в светло-коричневый цвет. Сперматозоиды с поврежденной акросомой окрашиваются в бледно-розовый. Результат окраски акросомы сперматозоида ØПри выявлении сперматозоидов с интактной акросомой менее 60%, спермопроба будет выбраковываться и не допускаться к искусственному осеменению животных Набор красителя Дифф-Квик

РАЗРАБОТКА СОВРЕМЕННЫХ ТРЕБОВАНИЙ И ПРАВИЛ МОНИТОРИНГА КАЧЕСТВА СПЕРМЫ БЫКОВ ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ ПО ЭПИЗООТИЧЕСКИМ, ГЕНЕТИЧЕСКИМ И РЕПРОДУКТИВНЫМ ПАРАМЕТРАМ. Подтема 1. Изучение морфофункциональных особенностей и биологических характеристик генетического материала КРС. Определение индекса фрагментации ДНК в замороженной сперме у животныхпроизводителей Ø Метод основан на определение индекса фрагментации ДНК в сперматозоидах. Ø Данный метод является технологическисовременным анализом маркеров апоптоза и играет важную роль в регуляции фертильности, которую нужно учитывать при осеменении животных Ø Результаты: в норме сперматозоид приобретает зеленое окрашивание При фрагментации ДНК сперматозоид приобретает окрашивание в диапазоне от желтого до красного цвета Ø При фрагментации ДНК в сперматозоидах более 30%, спермопроба выбраковывается и не допускается к искусственному осеменению животных. Фрагментация ДНК сперматозоида