ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «УФИМСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НЕФТЯНОЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» ФЕРМЕНТОПОДОБНЫЕ ПОЛИМЕРЫ РАХМАТУЛЛИН Р. Р.

ФЕРМЕНТОПОДОБНЫЕ ПОЛИМЕРЫ Иммобилизованные ферменты имеют ряд преимуществ в сравнении со свободными молекулами: гетерогенные катализаторы, легко отделяются от реакционной среды, могут использоваться многократно Обеспечивают непрерывность каталитического процесса иммобилизация ведет к изменению свойств фермента: субстратной специфичности, устойчивости, зависимости активности от параметров среды иммобилизованные ферменты долговечны и Иммобилизованными в тысячи и десятки тысяч раз стабильнее ферментами называются свободных энзимов. Так, происходящая при температуре 65 °С термоинактивация ферменты, искусственно лактатдегидрогеназы, иммобилизованной в связанные с нерастворимым 60 % м полиакриламидном геле, замедлена в 3600 раз по сравнению с нативным носителем, но сохраняющие ферментом. свои каталитические Все перечисленное обеспечивает высокую свойства. экономичность, эффективность и конкурентоспособность технологий, использующих иммобилизованные ферменты.

Носители для иммобилизации ферментов Носители Органические неорганической полимерные природы(материал носители ы из стекла, глины, керамики, графитовой сажи, Синтетические силикагеля, а полимерные также силохромы, носители(полимеры на оксиды металлов). Природные основе стирола, полимерные акриловой кислоты, носители(белковые, полисахаридные и поливинилового спирта; липидные ) полиамидные и полиуретановые полимеры.

Преимущества природных носителей: доступность, Полифункциональность гидрофильность, Недостатки: биодеградируемость достаточно высокую стоимость. Из полисахаридов для иммобилизации наиболее часто используют целлюлозу, декстран, агарозу (агар) и их производные. Для придания химической устойчивости линейные цепи целлюлозы и декстрана поперечно сшивают эпихлоргидрином. В полученные сетчатые структуры довольно легко вводят различные ионогенные группировки. Химической модификацией крахмала сшивающими агентами (формальдегид, глиоксаль, глутаровый альдегид) синтезирован новый носитель губчатый крахмал, обладающий повышенной устойчивостью к гликозидазам. Из природных аминосахаридов в качестве носителей для иммобилизации применяют хитин, который в значительных количествах накапливается в виде отходов в процессе промышленной переработки крабов и креветок. Хитин химически стоек и имеет хорошо выраженную пористую структуру. Среди белков практическое применение в качестве носителей нашли структурные протеины, такие, как кератин, фиброин, коллаген и продукт переработки коллагена желатина. Эти белки широко распространены в природе, поэтому доступны в значительных количествах, дешевы и имеют большое число функциональных групп для связывания фермента. Белки способны к биодеградации, что очень важно при конструировании иммобилизованных ферментов для медицинских целей. К недостаткам белков как носителей в этом случае следует отнести их высокую иммуногенность.

Методы иммобилизации ферментов

Адсорбция ферментов на нерастворимых носителях. При адсорбционной иммобилизации белковая молекула удерживается на поверхности носителя за счет электростатических, гидрофобных, дисперсионных взаимодействий и водородных связей. Эффективность адсорбции молекулы белка на носителе определяется удельной поверхностью (плотностью центров сорбции) и пористостью носителя. Процесс адсорбции ферментов на нерастворимых носителях отличается крайней простотой и достигается при контакте водного раствора фермента с носителем (статистическим способом, при перемешивании, динамическим способом с использованием колонок). С этой целью раствор фермента смешивают со свежим осадком, например, гидроксида титана, и высушивают в мягких условиях. Активность фермента при таком варианте иммобилизации сохраняется практически на 100 %, а удельная концентрация белка достигает 64 мг на 1 г носителя. К недостаткам адсорбционного метода следует отнести невысокую прочность связывания фермента с носителем. При изменении условий иммобилизации могут происходить десорбция фермента, его потеря и загрязнение продуктов реакции. Существенно повысить прочность связывания фермента с носителем может предварительная его модификация (обработка ионами металлов, полифункциональными агентами полимерами, белками, гидрофобными соединениями, монослоем липида и пр. ). Иногда, наоборот, модификации подвергается молекула исходного фермента, однако зачастую это ведет к снижению его активности.

Иммобилизация ферментов путем включения в гель. Метод применим для иммобилизации не только индивидуальных ферментов, но и мультиэнзимных комплексов и даже интактных клеток. Иммобилизацию ферментов в геле осуществляют двумя способами. В первом случае фермент вводят в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию, в результате которой возникает пространственная структура полимерного геля с включенными в его ячейки молекулами фермента. Во втором случае фермент вносят в раствор уже готового полимера, который впоследствии переводят в гелеобразное состояние. Для первого варианта используют гели полиакриламида, поливинилового спирта, поливинилпирролидона, силикагеля, для второго гели крахмала, агара, каррагинана, агарозы, фосфата кальция.

Иммобилизация ферментов в полупроницаемые структуры Сущность этого способа иммобилизации заключается в отделении водного раствора фермента от водного раствора субстрата с помощью полупроницаемой мембраны, пропускающей низкомолекулярные молекулы субстратов и кофакторов, но задерживающей большие молекулы фермента. Разработано несколько модификаций этого метода, из которых интерес представляет микрокапсулирование и включение ферментов в липосомы. Достоинства метода микрокапсулирования простота, универсальность, возможность многократного использования нативного фермента (фермент может быть отделен от непрореагировавшего субстрата и продуктов реакции процедурой простого фильтрования). Особенно существенно, что методом микрокапсулирования могут быть иммобилизованы не только индивидуальные ферменты, но и мультиэнзимные комплексы, целые клетки и отдельные фрагменты клеток. К недостаткам метода следует отнести невозможность инкапсулированных ферментов осуществлять превращения высокомолекулярных субстратов.

Химические методы иммобилизации ферментов. Иммобилизация ферментов на носителях, обладающих гидроксо- группами.

Иммобилизация ферментов носителях, обладающих аминогруппами. Иммобилизация на носителях, обладающих активированными производными карбоксильной группы. Иммобилизация на носителях, обладающих сульфгидрилъными группами.

ПРОМЫШЛЕННЫЕ ПРОЦЕССЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ иммобилизованных ферментов. В настоящее время в мире разработаны следующие крупномасштабные производства с использованием иммобилизованных ферментов и клеток: 1. Получение глюкозофруктозных сиропов. 2. Получение оптически активных L аминокислот из их рацемических смесей. 3. Синтез L аспарагиновой кислоты из фумарата аммония. 4. Синтез L аланина из L аспарагиновой кислоты. 5. Синтез L яблочной кислоты из фумаровой кислоты. 6. Получение безлактозного молока. 7. Получение сахаров из молочной сыворотки. 8. Получение 6 аминопенициллановой кислоты.

Получение полимерных имплантантов Разработаны методы получения имплантантов коллагена путем облучения смеси мономеров или полимеров с коллагеном. Имплантанты хорошо совместимы с кровью и не вызывают воспалений. Имплантанты применяются в хирургии и могут использоваться как субстраты в биотехнологии. Изучены протезы на основе полиэфируретана с радиационно модифицированной внутренней поверхностью. Модифицирование осуществлялось путем радиационной прививки 2 гидрокси метилакрилата или акриламида на внутреннюю поверхность трубок. Протезы изучались in vivo. Исследованы гистологические и механические свойства протезов. Установлена их повышенная тромборезистентность. Разработан метод модифицирования наполнителей для полимеров, используемых в зубоврачебной технике. Наполнители на основе стеклянных или кварцевых волокон модифицированы радиационной прививкой акриловой кислоты из паровой фазы. Подробно изучены физико механические свойства смол, содержащих различное количество модифицированного наполнителя. Отмечены преимущества используемого модифицированного наполнителя по сравнению с наполнителем, модифицированным силанами. С использованием облучения смесей глинозема с акриловой кислотой созданы полимерно керамические материалы для стоматологии. С помощью радиационной прививочной полимеризации созданы имплантанты для лечения кожи на пораженных ожогом участках человеческого тела. Для этой цели обычно используют силиконовый каучук, модифицированный прививкой гидрофильных мономеров или модифицированный вулканизованный натуральный каучук. С использованием радиационной технологии создан метод гидрофилизации силиконовых контактных глазных линз.

Иммобилизация лекарственных препаратов наибольшие успехи достигнуты при иммобилизации противоопухолевых составов в полимерные матрицы. Для иммобилизации противоопухолевых препаратов обычно используют различные сополимеры и композиции полиэтиленгликоль метакрилатов с различными полимерами (полистирол, поливинилформаль, полиэтиленгликоль, полиметилметакрилат, полиэтиленоксид). Под черкивается, что облучение необходимо проводить в бескислородной среде, а доза не должна превышать 10 к. Гр, в противном случае активность противоопухолевых препара тов существенно снижается Скорость выделения лекарств регулируют введением в полимерную матрицу порообразующего агента или адсорбента (например, активи рованного угля). Технология использования иммобилизованных противоопухолевых препаратов может быть улучшена за счет варьирования гидрофильно гидрофобных свойств полимерной матрицы, а также использования биодеградируемых полимеров (полипептиды или полилактиды). Преимуществом радиационной полимеризации для иммобилизации антител является достаточно высокая чистота получаемого продукта. Эти препараты можно использовать для иммунологического анализа. Проведены исследования по иммобилизации антагониста кальция в предварительно полимеризованный гель поли (2 гидроксиэтилметакрилата). Путем радиационного сшивания геля и добавок метилметакрилата и N винилпирролидона можно широко варьировать скорость выделения лекарства. Исследована иммобилизация гидрокортизона в гели, полученные радиационной полимеризацией акриловой кислоты. Скорость выделения регулируется дозой облуче ния и обработкой гелей ацетатом цинка.

Иммобилизация компонентов крови Гемоглобин был иммобилизован в полимерную матрицу из поли(2 гидроксиэтилметакрилата) с использованием радиационной низкотемпера турной полимеризации. Особое внимание было уделено выбору оптимальных условий иммобилизации для защиты гемоглобина. Гемоглобин удобен для изучения состояния иммобилизованной молекулы в полимерной матрице, так как он имеет характерное оптическое поглощение. Гемоглобин в мембране подвергался обратимой оксигенации, которая имеет почти то же самое значение, что и в нативном гемоглобине. Описан способ получения полу синтетической крови на основе иммобилизованного карбоксигемоглобина. В работах для иммобилизации гемоглобина использована радиационная полимеризация фосфолипидов. Фосфолипиды содержали две длинные полимеризуемые октадекадиенильные группы. Искусственные красные кровяные клетки были получены путем капсулирования гемогло бина с использованием радиационной полимеризации бислойных фосфолипидов — липосом. Искусственные кровяные клетки оказались механически стабильными, легко выдерживали замораживание. Кислородный транспорт подобных систем оказался подобен транспорту нативного гемоглобина. Проводились испытания in vivo (мыши), которые указали на биосовместимость таких клеток.

Получение «умных» полимеров и их использование для иммобилизации биологически активных веществ Так называют полимеры, способные реагировать (сжиматься или набухать) на небольшие изменения во внешней среде (температура, р. Н, электрическое поле и т. д. ). «Умные» полимеры с иммобилизованными БАВ используются для выделения лекарств при определенных условиях, как правило, при заданной температуре или р. Н. Обычно «умные» полимеры получают традиционными методами, однако в последнее время, для этой цели стала использоваться также радиационная полимеризация. Среди «умных» полимеров наибольшее число публикаций посвящено поли( N изопропилакриламиду) (поли N ИПАА). Данный полимер имеет в воде нижнюю критическую температуру растворения (НКТР) ~32°С, т. е. близкую к температуре человеческого тела. Выше 32°С происходит фазовое разделение, обусловленное конформационным переходом макромолекулы поли N ИПАА из рыхлой глобулы в компактный клубок, что сопровождается резким уменьшением размеров макромолекулы. Было изучено поведение гидрогелей, полученных на основе поли( N изопропилакриламида) и скорость диффузии иммобилизованных в них лекарственных препаратов в условиях имитирующих человеческий организм. Было установлено, что при 37 0 С и р. Н=1, 4 (нормальные условия в желудке человека) происходит медленное выделение иммобилизованных в гидрогель индометацина и амилазы, но при изменении величины р. Н до 7, 4 (условия в кишечнике) выделение лекарств значительно ускоряется. Таким образом, можно создавать лекарственные формы, позволяющие доставлять препарат к пораженному органу без значительных потерь. Другим направлением использования таких “умных” полимеров является создание сигнал чувствительных систем, состоящих из биосенсора, активатора и резервуара для коррекции нарушений в работе различных органов в организме человека. Так для больных диабетом разрабатываются специальные системы с биосенсором на глюкозу, которые запускаются по принципу включение выключение для выделения определенных порций инсулина, иммобилизованного в гелях, т. е. работающие по принципу поджелудочной железы.

Спасибо За Внимание