Фармакогнозия как наука Методы фармакогностического анализа Савостин Владислав

Фармакогнозия как наука. Методы фармакогностического анализа Савостин Владислав Сергеевич к. б. н. , доцент кафедры организации фармацевтического дела, клинической фармации и фармакогнозии

1. Общие понятия о дисциплине, задачи фармакогнозии. Основные термины и понятия.

http: //moodle. vsmaburdenko. ru/

n Фармакогнозия (от греч. pharmakon – лекарство, яд и gnosis - познание) - фармацевтическая наука, занимающаяся всесторонним комплексным изучением лекарственных растений, лекарственного сырья растительного и животного происхождения, а также продуктов их первичной переработки (эфирные и жирные масла, смолы, млечные соки и др. )

Задачи фармакогнозии n n изучение лекарственных растений как источников биологически активных веществ изучение ресурсов лекарственных растений нормирование и стандартизация лекарственного сырья изыскание новых лекарственных средств растительного происхождения с целью пополнения и обновления ассортимента лекарственных средств, создания более эффективных лекарственных препаратов

2. Основные термины и понятия фармакогнозии n n n лекарственные растения лекарственные средства лекарственные препараты лекарственная форма лекарственное растительное сырье лекарственный растительный препарат

Структура Фармакопейной статьи на лекарственное растительное сырьё n n n Латинское название сырья Русское название сырья Латинское и русское название производящего растения (и его семейства), из которого изготовляется ЛРС. Раздел: Внешние признаки Раздел: Микроскопия Раздел: Качественные реакции (т. е. методы анализа) Раздел: Числовые показатели Количественное определение (т. е. подробная методика содержания действующих веществ) Упаковка сырья Срок годности сырья Фармакотерапевтическое действие (кратко даётся одно или два)

2. Методы фармакогностического анализа Фармакогностический анализ – это комплекс методов, позволяющий определять подлинность и доброкачественность ЛРС.

n n Подлинность – соответствие исследуемого объекта наименованию, под которым он поступил на анализ. Доброкачественность – соответствие ЛРС требованиям НД.

Методы фармакогностического анализа n n Макроскопический Микроскопический Фито-химический Товароведческий

n Макроскопический метод – изучение морфологических признаков ЛРС невооруженным глазом или с помощью лупы и выделение из них диагностических, т. е. присущих данному ЛРС признаков (форма, размеры, цвет, запах, вкус).

Макроскопический анализ сырья проводят по морфологическим группам сырья n n ЛИСТЬЯ (FOLIA) Листьями в фармацевтической практике называют ЛРС, представляющее собой высушенные или свежие листья или отдельные листочки сложного листа.

n n n ЦВЕТКИ (FLORES) Цветками в фармацевтической практике называют ЛРС, представляющее собой отдельные цветки или соцветия, а так же их части. Цветки обычно собирают в начале цветения в фазу полного цветения, некоторые в фазу бутонизации, тогда сырьё называют «бутоны» .

n n n ТРАВЫ (HERBAE) Травами в фармацевтической практике называют ЛРС, представляющее собой высушенные или свежие надземные части травянистых растений (стебли, листья, цветки или бутоны, иногда плоды, чаще всего плоды незрелые). У высокорослых растений заготавливают только верхушки (пример: пустырник, зверобой, душица). У низкорослых — заготавливают всё растение, иногда с корнями (напр. якорцы, сушеница).

n n ПЛОДЫ (FRUCTUS) Плодами в фарм. практике называют ЛРС, представляющее собой простые и сложные, высушенные, реже свежие, а так же ложные плоды, соплодия и их части.

n n СЕМЕНА (SEMINA) Семенами в фармацевтической практике называют ЛРС, представляющеещее собой высушенные цельные семена и отдельные семядоли. КОРЫ (CORTICES) Корами в фармацевтической практике называют ЛРС, представляющее собой высушенную наружную часть стволов, ветвей и корней деревьев и кустарников, расположенную к периферии от камбия.

n ЛРС подземных органов растений n КОРНИ (RADICES) Корнями в фарм. пр-ке наз-ют ЛРС, представляющее цельные или в кусках высушенные корни растений, собранные осенью или ранней весной, очищенные или отмытые от земли, освобожденные от отмерших корней и надземных частей, иногда от мелких корней. КОРНЕВИЩА (RHIZOMATAЕ) Корневищами в фарм. практике называют ЛРС, представляющие собой цельные корневища или их куски, собранные осенью или весной, очищенные или отмытые от земли, освобожденные от корней, стеблей и листьев. n n n

n n КОРНЕВИЩА И КОРНИ (RHIZOMATAE ET RADICES) Корневища и корни — это ЛРС, представляющее собой отдельные куски корней и отдельные куски корневищ, собранные осенью или ранней весной, очищенные или отмытые от земли, КОРНЕВИЩА С КОРНЯМИ (RHIZOMATAE CUM RADICIBUS) Корневища с корнями — это ЛРС, представляющее собой цельные корневища, реже их куски с неотделимыми от них многочисленными корнями, собранные осенью или ранней весной, очищенные или отмытые от земли, освобожденные от отмерших частей и остатков листьев и стеблей.

Как сырье в медицине используют также: n ПОЧКИ (gemmae), n БУТОНЫ (alabastrae), n ПОБЕГИ (cormus), n ЛУКОВИЦЫ (bulbi), n КЛУБНИ (tubera), n КЛУБНЕЛУКОВИЦЫ (bulbotubera).

Микроскопический анализ ЛРС n – изучение анатомического строения сырья (цельного и измельченного) и выявление из всего многообразия признаков диагностических, т. е. присущих данному виду сырья

Основными анатомо-диагностическими признаками листьев являются: n n n n Строение эпидермиса Тип устьичного комплекса Виды трихом (волоски, железки) различают головчатые, простые и т. д. Наличие включений в мезофилле листа как правило, это могут быть кристаллы оксалата кальция в разных модификациях (друзы, рафиды и др. ), а так же млечники, вместилища, секреторные канальцы (ходы), карбонат кальция в виде специальных образований (цистолитов) как, например, у крапивы. При микроскопическом анализе тонких листьев готовят микропрепараты листа с поверхности. Из толстых и кожистых листьев при необходимости готовят поперечные срезы. При МА трав, как правило, для исследования берут листья.

При анализе плодов и семян готовят препараты кожуры семени и околоплодника с поверхности и делают поперечные срезы. n При МА поперечного среза плодов диагностическое значение имеет: q Строение околоплодника q Форма и строение клеток эпидермиса, наличие и особенности строения волосков q Наличие механических элементов, их форма и расположение q Число и расположение эфирномасличных канальцев q Наличие кристаллических включений

При МА КОР обращают внимание на : n n n n - Особенности строения пробки (толщина, количество слоев, окраска) - Наличие колленхимы - Соотношение толщины первичной и вторичной коры - Сердцевинные лучи, количество рядов клеток в них - Механические элементы (лубяные волокна, склереиды, их расположение) - Основная паренхима (форма клеток) - Наличие кристаллических включений Крахмальные зерна в корах мелкие, поэтому диагностич. значения не имеют.

МА подземных органов растений При анализе корней, корневищ готовят как поперечные, так и продольные срезы. Следует обратить внимание на: n Характер расположения проводящих тканей (пучковое, беспучковое) n Наличие механических элементов n Особенности строения флоэмы n Наличие и форма кристаллов n Наличие вместилищ и млечников, а так же запасных питательных веществ (крахмал, инулин, слизь, жирное масло) n

Фитохимический анализ n Химический анализ ЛРС – позволяет на основе физико-химических свойств БАВ ЛР доказывать их присутствие в сырье (качественный химический анализ) и определять количественное содержание.

КАЧЕСТВЕННЫЙ ХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ n Проводится по методикам, приведенным в разделе «качественные реакции» НД, нормирующее качество ЛРС. В этом случае готовят водные или спиртовые извлечения сырья с которыми проводят реакции. n Реакцию можно провести и на сухом сырье, нанося каплю реактива на свежий излом (если это корни или корневища) или на внутреннюю поверхность (для коры). n Так же возможно проведение хроматографических проб. n По технике проведения и обнаружения результата реакции качественные реакции можно поделить на три группы: n А) Собственно-качественные реакции проводят в пробирке с извлечением или на сухом сырье. Результат реакции наблюдается невооруженным глазом. n Б) Микрохимические реакции проводят на предметном стекле с соскобом сырья, с порошком или извлечением из сырья. Результат реакции наблюдается под микроскопом. n В) Гистохимические реакции проводят на срезах микропрепаратов с поверхности. Результат реакции наблюдается под микроскопом. n n ! Микрохимическая реакция даёт возможность обнаружить конкретное вещество, а гистохимическая реакция показывает, где конкретно (в каких тканях, образованиях) располагается вещество. n

Собственно-качественные реакции n I. Качественные реакции выполняют на сухом сырье с такими видами сырья: коры дуба, калины, крушины, корневища бадана, корневища и корни девясила, корни одуванчика, алтея, жень-шеня, барбариса, цветки липы, семена льна, склероции спорыньи (всего по существующей НД - для 12 видов сырья). n II. В основном качественные реакции проводят с извлечением из лекарственного растительного сырья. n Исходя из свойств биологически активных веществ, их извлекают из сырья водой, спиртом различной концентрации или органическим растворителем, реже с добавлением щелочи или кислоты. n Водное извлечение готовят из сырья содержащего гликозиды. полисахариды, сапонины, фенологликозиды, антрагликозиды, дубильные вещества. Подкисленной водой извлекают из сырья алкалоиды в виде солей. n Большую группу биологически активных веществ извлекают этиловым и метиловым спиртом различной концентрации (сердечные гликозиды, кумарины, лигнаны, фловоноиды). n n

n n n n Если реакция достаточно специфична и чувствительна, то ее проводят с неочищенным извлечением из сырья. Например: 1) общеалкалоидные осадочные реакции; 2) реакции с раствором хлорида алюминия на флавоноиды (трава зверобоя, горца птичьего, г. перечного и др. ); 3) проба Синода на флавоноиды в цветках бессмертника; 4) реакция с раствором щелочи на антраценпроизводные (кора крушины, корни ревеня и др. ); 5) реакция с раствором железоаммонийных квасцов на дубильные веществ (кора дуба, корневища змеевика, бадана и др. ). Часто проведению реакции мешают сопутствующие вещества (белки, амины, стерины, хлорофилл), в этом случае используют очищенное извлечение (например, из сырья, содержащего сердечные гликозиды, кумарины, алкалоиды, фенологликозиды, лигнаны). Очищают извлечение осаждением сопутствующих веществ раствором ацетата свинца и сульфата натрия или используют прием смены растворителей, либо метод распределительной хроматографии.

n n n Микрохимические реакции 1) на эфирное и жирное масло с раствором Судан III; 2) на одревесневшие лигнифицированные элементы с раствором флороглюцина и 25 %-ным раствором серной кислоты или конц. хлороводородной кислоты. На кору дуба (порошок) проводят реакцию с железоаммонийными квасцами и результат реакции изучают под микроскопом. Гистохимические реакции По ГФ-ХI гистохимические реакции проводят на слизь с раствором туши в корнях алтея и семенах льна.

n n n Люминесцентный анализ ЛРС основан на том, что многие вещества, вырабатываемые растениями, обладают люминесценцией. Преимущество метода - применение его для изучения сухого материала, из которого готовят толстые срезы. Метод показывает наличие действующих веществ и их локализацию. Люминесцентная микроскопия выполняется с помощью специального микроскопа или с помощью обычных биологических микроскопов, снабженных люминесцентными осветителями. Вещества рассматривают в УФ-свете, наблюдая первичную люминесценцию вещества. Недостатки метода: способностью люминесцировать обладают не только БАВ, но и другие вещества растений, например, одревесневшие элементы, кутинизированные оболочки. Не люминесцируют кристаллы оксалата кальция и хлорофилла в сухом сырье.

Хроматографический анализ n Для разделения многокомпонентных смесей, какими являются извлечения из сырья, для очистки и идентификации соединений используют хроматографию. n По механизму, лежащему в основе разделения, различают адсорбционную, распределительную, ионообменную и газожидкостную хроматографию. n Чаще используют распределительную восходящую хроматографию на бумаге и в тонком слое сорбента - силикагель, окись алюминия, различные полимеры и др. (неподвижная фаза). В качестве подвижной фазы используют систему растворителей. n При хроматографировании анализируемые вещества образуют на бумаге или пластинке зоны или пятна, которые обнаруживают по их свечению в ультрафиолетовом свете. В зависимости от химической природы вещества будет наблюдаться характерная флюоресценция (см. физические свойства веществ). n Достоверность идентификации сырья методом хроматографии повышается, если полученную хроматограмму проявить хромогенными реактивами. Используют реактивы для качественных реакций, которые дают специфические, устойчивые окраски. n Методом хроматографии на бумаге подтверждают подлинность сырья, содержащего флавоноиды, алкалоиды, антраценпроизводные, кумарины. n n

При анализе побегов багульника болотного (ГФ-ХI) и его эфирного масла, используемых для производства препарата "Ледин", применяют метод газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Неподвижной фазой является жидкость, нанесенная на твердый инертный носитель, а подвижной фазой является газ. Разделение компонентов происходит за счет различной растворимости компонентов эфирного масла в неподвижной фазе (жидкости). n В последнее время успешно развивается высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) (для выделения сердечных гликозидов). Это вариант колоночной хроматографии на полиамиде, но подвижная фаза (жидкость) проходит через колонку с большой скоростью за счет высокого давления. n

Количественный химический анализ. n Методики определения количественного содержания действующих веществ описаны в соответствующей частной нормативной документации. n Выбор метода зависит от физических и химических свойств БАВ. n Используют гравиметрические (весовые), титриметрические (объемные) и физико-химические (инструментальные) методы анализа. n Гравиметрические методы n Гравиметрические (весовые) методы основаны на выделении суммы веществ путем их осаждения из различных растворителей или за счет получения нерастворимых комплексных соединений и последующим установлении массы осадка n Гравиметрический метод предложен в ГФ-ХI на листья подорожника большого, траву череды, слоевища ламинарии (полисахариды); в частных НД - на сырье безвременника, дурмана индейского, плауна-баранца (алкалоиды). n

n n n Титриметрические методы Титриметрические (объемные) методы основаны на химических свойствах биологически активных веществ: 1. На их способности легко окисляться: - перманганатом калия (дубильные вещества); - раствором иода (простые фенольные соединения - арбутин); - 2, 6 -дихлорфенолиндофеолятом натрия (аскорбиновая кислота). 2. На основных свойствах основаны титриметрические методы определения алкалоидов. Алкалоиды ведут себя как основания и могут быть определены путем: - прямого титрования (например, сырье анабазиса, софоры толстоплодной, чилибухи); - обратного титрования (сырье белены, дурмана, красавки, трава термопсиса, корневища с корнями чемерицы) растворами кислот. Слабые основания определяют методом кислотно-основного титрования в неводных средах. Точку эквивалентности устанавливают по индикатору или потенциометрически (ГФ-ХI - трава чистотела - метод неводного потенциометрического титрования). Титриметрические методы экономичны, быстры в исполнении, но недостаточно точны и дают завышенные результаты.

Физико-химические методы n Наиболее точны и высокочувствительны фотометрические методы (фотоколориметрия и спектрофотометрия), основанные на измерении количества света, поглощенного веществом, суммой веществ или комплексом вещества в видимой, ультрафиолетовой и инфракрасной области спектра. Используют фотометрические методы для определения почти всех групп биологически активных веществ (сердечные гликозиды, экдистероны, сапонины, кумарины, хромоны, лигнаны, флавоноиды, антраценпроизводные, дубильные вещества, алкалоиды, каротиноиды). n Фотоэлектроколориметрические методы основаны на измерении степени поглощения немонохроматического (полихроматического) света на довольно широком участке спектра окрашенных растворов с помощью фотоэлектроколориметра. n Спектрофотометрические методы основаны на способности вeщeств или их окрашенных продуктов реакции избирательно поглощать монохроматический свет в определенной области спектра. Такими свойствами обладают флавоноиды, кумарины, антраценпроизводные, сапонины, индивидуальные алкалоиды, экдистероны. Измерение проводят с помощью спектрофотометра. n Наиболее точными являются хроматоспектрофотометрические методы. основанные на разделении веществ при помощи хроматография с последующим их определением спектрофотометрически. Можно определять количественное содержание как суммы, так и индивидуальных веществ. Применяют для определения индивидуальных алкалоидов (цитизин в траве термопсисе очередноцветкового, берберин в корнях барбариса), флавоноидов (плоды и цветки боярышника, трава сушеницы), кумаринов (плоды амми большой), ксантонов (трава золототысячника), ланатозидов в сырье наперстянки шерстистой. n Реже для анализа лекарственного растительного сырья применяется флюорометрия, полярография, денситометрия, амперометрия, кондуктометрия. n

Определение эфирного масла n Методы количественного определения основаны на легкой летучести эфирных масел и способности их перегоняться с водяным паром. В зависимости от физических и химических свойств компонентов, входящих в состав масла, используют 4 метода. Все методики описаны в ГФ-ХI изд. , вып. 1, стр. 290 в разделе "Общие методы анализа". Содержание масла выражают в объемно-весовых процентах. n Определение сердечных гликозидов n Все лекарственное растительное сырье, содержащее сердечные гликозиды подвергается биологической стандартизации на лягушках, кошках, голубях. Активность выражается соответственно в ЛЕД, КЕД, ГЕД. Общие методы оценки биологической активности описаны в ГФ-ХI, вып. 2, стр. 163 в разделе "Биологические методы контроля качества лекарственных средств". Особенности методики определения приведены в соответствующих частных нормативных документах. n Метод основан на способности сердечных гликозидов вызывать в токсических дозах остановку сердца животных в стадию систолы. Чувствительность животных к сердечным гликозидам определяют в сравнении со станадартом. n Недостатками метода биологической стандартизации являются его трудоемкость, высокая стоимость, большая ошибка опыта (до 25%). n

n Товароведческий анализ включает правила приемки сырья, регламентирует отбор проб для проведения испытаний сырья на содержание примесей, степени измельченности, зараженности вредителями, определения микробиологической чистоты, радиационного контроля, содержания золы, влаги, действующих веществ. В тех случаях, когда действует комплекс БАВ или не разработан метод количественного определения действующих веществ, проводят определение экстрактивных веществ. Это масса сухого остатка, полученного после упаривания вытяжки из ЛРС, полученной с помощью определенного растворителя, указанного в НД на определенный вид сырья. n