Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Laboratório

Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Laboratório de Biologia Celular e Molecular Estudo da caspase-3 e da dismútase do superóxido no córtex supra-renal após administração crónica de ACTH Aplicação de bombas osmóticas intra-peritoneais: efeito de 3 dosagens de ACTH na secreção de corticosterona Fátima Leal Seabra (Orientador: Prof. Doutor Henrique Almeida)

Objectivos do estudo p Objectivos gerais: Aplicação de técnicas laboratoriais leccionadas durante as aulas de Biologia Celular e Molecular p Dar a conhecer a vivência laboratorial p Estimular a curiosidade no domínio da investigação p p Objectivo específico: p Pesquisa da expressão de Mn. SOD e do factor apoptótico caspase-3, por imunocitoquímica, em animais tratados com ACTH

Razões p Pesquisa de Mn. SOD: n p Verificou-se que a administração aguda de ACTH aumenta a sua expressão, mas desconhece-se o efeito da administração crónica Colateralmente, n Tendo-se observado que a supressão de ACTH aumenta a expressão de caspase-3, indagouse se a sua administração crónica a diminui.

Introdução-Índice p A Glândula supra-renal p Radicais livres e dismútase do superóxido p A caspase-3

A glândula supra-renal (GSR) www. emc. maricopa. edu cai. md. chula. ac. th Ultra-estrutura das células do Córtex de GSR

A hormona adrenocorticotrófica p A hormona adrenocorticotrófica (ACTH) é o maior estimulante da secreção das hormonas adrenocorticais, nomeadamente dos glicocorticóides (corticosterona e cortisol) www. aafp. org/

Fontes e consequências dos radicais livres Fontes endógenas: Fontes exógenas: • Cadeia respiratória • Fumo do tabaco • Reacções enzímicas • Reacções de autooxidação Produção de radicais livres • Poluentes • Luz UV • Radiações ionizantes • Xenobióticos Metais de transição Peroxidação lipídica Modificações nas bases de DNA Lesão dos tecidos Alterações proteicas Antioxidantes in health disease, IS Young et al, J Clin Pathol 2001, 54: 176 -186 (adaptação)

Defesas dos antioxidantes Enzimas antioxidantes: • dismútase do superóxido Produção de radicais livres Proteínas que se ligam aos metais: • catálase • transferrina • peroxídase da glutationa • ferritina Metais de transição • lactoferrina Outras substâncias: • fases lipídicas: • fases aquosas § tocoferóis • ascorbato §ubiquitinol • urato §carotenóides • glutationa §flavonóides Lesão dos tecidos Mecanismos de reparação Antioxidantes in health disease, IS Young et al, J Clin Pathol 2001, 54: 176 -186 (adaptação)

A dismútase do superóxido, SOD p Há 3 isoformas: p Intracelulares § SOD cobre-zinco (Cu. Zn. SOD) § Massa molecular de 32 k. Da § Homodímero § Encontrada em organelos e no citoplasma § SOD manganésio (Mn. SOD) § Massa molecular de 40 k. Da § Homotetrâmero § Presente em mitocôndrias, nomeadamente de GSR § Distingue-se da Cu. Zn. SOD pois não é inibida com cianeto

A dismútase do superóxido, SOD Extracelular § SOD extracelular (EC-SOD) Massa molecular de 135 k. Da § Tetrâmero § Contém um átomo de Zn e Cu em cada subunidade § Sintetizada em alguns tipos de células: § - células endoteliais - fibroblastos

A caspase-3 p Membro de uma família de proteases, com resíduos de cisteína (C) no seu local catalítico e que clivam proteínas-substrato no extremo carboxílico de resíduos de ácido aspártico (Asp). p “executora” da morte celular programada apoptose www. rcsb. org/pdb/newsletter/2004 q 3/caspases. gif

A caspase-3 Lesões nas mitocôndrias Libertação do citocromo c e de moléculas pró-apoptóticas (Smac/Diablo) Citocromo c induz a formação do apoptossoma (Apaf-1 e Caspase-9) Activação de uma via de caspases pela caspase-9 Activação da caspase-3 The Cell A Molecular Approach, Third Edition, Geoffrey M Cooper et al Nota: Smac/ Diablo promovem a apoptose interferindo com a acção dos IAPs que são inibidores das caspases

A caspase-3 Célula Normal Célula apoptótica medidacte. timone. univ-mrs. fr/. . . / apoptose. html Molecular Cell Biology, Fourth edition, Lodish et al

Métodos - Índice p Introdução de bombas osmóticas p Colheita e processamento de glândulas supra-renais: Microscopia de luz (imunocitoquímica) p Microscopia electrónica p

Introdução de Bombas Osmóticas p Ratos machos Wistar n n p 3 meses de idade Peso ~262 g Bombas osmóticas Alzet®, com p p Soro fisiológico (SF) ACTH com concentração de 1 mg/1 m. L

Introdução de Bombas Osmóticas p Anestesia com Sevorane® a 5% em mistura oxigénio: ar de 1: 2 p Laparotomia mediana inferior p Introdução das bombas na cavidade peritoneal p Sutura da parede abdominal Aplicação de Bombas Osmóticas intraperitoniais: Estudo do efeito de endotoxina na microestrutura da glândula supra-renal do rato, Michel Sapateiro Luís, 2003

Recolha das supra-renais e preparação para microscopia p Ao fim de 7 dias sacrificaram-se os animais por decapitação p Microscopia óptica p p Fixaram-se porções de glândula supra-renal em formol Incluíram-se em parafina Fizeram-se cortes com micrótomo e colocaram-se estes em lâminas com poli-L-lisina Microscopia electrónica p p p Fixaram-se porções de glândula supra-renal com glutaraldeído a 2, 5% em tampão cacodilato Inclusão em EPON Fizeram-se cortes ultrafinos que se colocaram em grelhas e se coraram para observar no microscópio electrónico

Imunocitoquímica da Mn. SOD 1. Desparafinação dos cortes 2. Hidratação 3. Bloqueio da peroxídase endógena com 4. Bloqueio com BSA 2% em TBS 5. Incubação com Anti-Mn. SOD (anticorpo I de coelho) durante 24 h 6. Incubação com anticorpo II, anti-coelho biotinilado durante 30 min 7. Adicionou-se o complexo ABC (Streptavidina Peroxídase) 8. Revelação com DAB 9. Contraste com Hematoxilina + Eosina 10. Mantagem com Entellan 11. Observação a microscopia de luz a 3%

Imunocitoquímica da Caspase-3 1. Desparafinação 2. Hidratação 3. Colocar os cortes em tampão de citrato até entrar em ebulição 4. Baixar a temperatura 5. Inibição da peroxídase endógena por adição 6. Bloqueou-se com BSA 5% em TBS-T 7. Adicionou-se anticorpo I de coelho durante 24 h 8. Incubação 30 min com anticorpo II, anti-coelho, biotinilado 9. Incubação complexo ABC 10. Revelação com DAB 11. Contraste com hematoxilina e eosina 12. Montagem com Entellan 13. Observação a microscopia de luz a 3%

Resultados -Índice p Microscopia electrónica p Microscopia óptica n n n Cortes semi-finos Imunocitoquímica da SOD Imunocitoquímica da caspase-3

Microscopia óptica Cortes semi-finos ZG da GSR no animal controlo ZG na GSR no animal tratado com ACTH

Resultados Microscopia electrónica mitocôndrias Inclusões lipídicas nucléolo REL GSR em que foi administrado soro fisiológico (SF) no animal heterocromatina GSR em que foi administrado ACTH no animal

Microscopia óptica Imunocitoquímica da Mn. SOD Cápsula ZG ZF córtex ZR medula GSR do animal em que houve administração de ACTH

Microscopia óptica Imunocitoquímica da Mn. SOD ZF da GSR no controlo (SF) ZF da GSR no animal tratado com ACTH

Microscopia óptica Imunocitoquímica da caspase-3 cápsula ZG ZF da GSR no animal em o ACTH foi administrado ZF Cápsula, ZG e ZF da GSR no animal controlo (SF)

Conclusões p A introdução de bombas osmóticas é tecnicamente fácil p É necessário aumentar o número de animais para confirmar os dados observados; p A administração de ACTH não altera a localização da expressão de Mn. SOD relativamente ao controlo e em ambos os casos há uma intensidade de marcação importante; p A marcação da caspase-3 ocorreu em núcleos e citoplasma da ZF/ZR após administração crónica de ACTH. É possível que tal resulte de: n Activação de processos apoptóticos, ainda sem expressão morfológica; n Activação de uma via de sinalização não associada a morte celular, em que a caspase-3 parece estar também envolvida

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Agradecimentos p Prof. Doutor Henrique Almeida p Drªs Liliana Matos e Adriana Rodrigues p D. Maria Amélia Ferreira e D. Elisa Galvão

Fim