Эволюция методов массового параллельного определения нуклеотидных последовательностей Every

Эволюция методов массового параллельного определения нуклеотидных последовательностей “Every problem has in it the seeds of its own solution. If you don’t have any problems, you don’t get any seeds. ” Norman Vincent Peale

Generation I : Sanger sequencing, 1000 н. п. / эксп Против Геном человека ~ 3 • 1 000 000

Аргоновый лазер 488+513. 8 нм мощность в луче около 10 м. Вт, потребляемая мощность 2 КВт Дифракционная решетка совмещенная с охлаждаемым CCD-экраном для спектрального анализа (в прежних образцах использовали механически сменяемые фильтры) Капилляр внутр. диметром 50 мкм Управляемый источник напряжения для электрофореза до 14 КВ Гель – модифицированный ЛПАА, автоматически заменяется за счет создание избыточного давления Электрокинетическое нанесение образцов

Один из цехов лаборатории секвенирования. Фото: The Broad Institute of MIT and Harvard.

«Геном Человека» Начат в 1990 году, под руководством Джеймса Уотсона под эгидой NIH США. 26 -го июня 2000 г. на пресс-конференции с участием президента США и премьер-министра Англии представители International Human Genome Sequencing Consortium (IHGSC) и “Celera Genomics” объявили о выпуске working draft генома человека 2003 Цена ~ г. – final version declared. 3 000 000 $ ( 3 миллиарда $ )

Next Generation MPSS - Massive Parallel Sequencing Systems Клональная амплификация разнесенных в пространстве фрагментов ДНК Одновременное считывание последовательностей большого числа фрагментов

Клональная амплификация 1: ПЦР в инвертированной эмульсии шариков воды в масле - e. PCR Journal of Biotechnology 2003, 102, 1/14 454 -based Roche Platforms

SOLi. D, Torrent ABI (Life Tech); 454 (Roche) platforms Достоинство: возможность переместить готовые beads в пространстве (в частности, позволяет произвести их селекцию) Недостатки: неоднородность капель по объему, ограниченность ресурсов ПЦР в объеме капли

2: ПЦР с образованием «молекулярных колоний» на подложке. Достоинства: - неограниченность ресурсов ПЦР - возможность чтения обеих цепей дц. ДНК ) SOLEXA (Illumina) SOLi. D Wild. Fire (ABI)

Считывание последовательности 1: Пиросеквенирование 454 -based Roche Platforms Достоинства: немного стадий, сигнал (свет) возникает непосредственно в процессе реакции Недостаток: «проблема гомополимеров»

2: Пошаговая терминация – детекция – удаление метки Illumina Platforms Недостаток: многостадийность, неполнота реакций ( «кошмар Эдмана» ); вероятность ошибки увеличивается по мере удаления от старта

3: Тандемное лигирование «встык» олигонуклеотидных зондов SOLi. D ABI Platforms Достоинства: ошибки более «равномерно» распределены по последовательности, каждая позиция прочитывается несколько раз; низкий уровень ошибок, возможность отличать замены в последовательности (SNP) от ошибок прибора Недостаток: многостадийность, неполнота реакций; небольшая (не более 75) длина последовательностей

The Future is SOLi. D Deletion 1 base A X B ACGGTCGTCGTGTGCGT ACGGTCGCGTGTGCGT 2 nd Base A 1 st Base A C G T 16 04. 2007 | EMT AM/MCB sales training Darmstadt © 2007 Applied Biosystems C G T

4: Детекция локального изменения p. H при включении d. NTPs Ion 314 chip Ion 318 chip Ion/Proton Torrent ABI Roche p. H sens. chip prototype ion sensitive transistor Достоинства: немного стадий, сигнал возникает непосредственно в процессе реакции и не требует преобразования (являсь изначально эл. импульсом) Недостаток: «проблема гомополимеров»

Life Science 454 (Roche Genome Sequencers) q 2000 год – в США учреждена компания « 454 Life Sciences» ; q 2004 год - к началу года компания продемонстрировала работоспособность своего подхода. Она получает от NIH гранты: - геномное секвенирование (2, 4 млн. $), - ультрамикрометод секвенирования геномов человека (5 млн. $ на 3 года). q 2008 год – продано более 100 приборов (Roche) q 2014 год – Roche прекращает продажи платформы

Результаты геномного секвенирования Mycoplasma genitalium и Staphylococcus aureus

Illumina Mi. Seq Hi. Seq 2000/1000 «Молекулярные колонии» на твердой подложке (2), возможность чтения обеих цепей дц. ДНК (Paired-End); Пошаговое присоедение флуоресцентно меченных терминаторов (2), после детекции метка и терминирующая группа удаляются химически;

Life Tech (ABI) e. PCR (1) или «Молекулярные колонии» на твердой подложке (2, Wild. Fire); SOLi. D 4 Тандемное лигироание флуоресцентно меченных зондов (3) SOLi. D 5500 e. PCR (1); 314 chip Ion PGM Ion Proton 316 chip Детекция локального изменения p. H при включении d. NTPs на микрочипе (4)

Прибор Длина чтения н. п. Число чтений, млн. Общая произв. , Gb/run Цена run chem, $/Gb Точность (Roche GS FLX+) 800 1 0. 65 9 500 высокая * (Roche Junior) до 800 0. 1 0. 035 19 500 высокая * Illumina Hi. Seq 2 × 150 300 -2000 60 -500 50 -300 средняя, падает с ростом длины ** Illumina Mi. Seq 2× 250 -300 15 -22 0. 5 - 10 100 - 1000 средняя, падает с ростом длины ** (2 ×) 50 1600 (2 × 800) 80 N/A 75 или 2 × 60 1400 (12 × 116) 155 67. 72 ABI Ion PGM 318 chip < 400 4. 75 < 1. 9 460 ABI Ion Proton I 175 70 12. 25 81. 63 (ABI SOLi. D 4) ABI SOLi. D 5500 *ошибки на гомополимерах ** ***внутренний контроль ошибок высокая *** высокая*** средняя, падает с ростом длины * Read Length 1 × 36 2 × 25 2 × 100 2 × 150 Bases > Q 30 > 90% > 85% > 75% http: //www. molecularecologist. com/next-gen-fieldguide-2014 http: //www. molecularecologist. com/next-gen-table-2 -2014/

Недостатки использования клональной амплификации Ограничение на длину чтения (< 1000 для e. PCR); Искажение представленности контекстов, появление «мертвых зон» ; Сложная многостадийная пробоподготовка с возможностью дополнительного искажения представленности контекстов;

Duplicated r. RNA genes: rrs. E & rr. IE

Rapid wholegenome mutational profiling using next-generation sequencing technologies. Douglas R. Smith, Aaron R. Quinlan, Heather E. Peckham, et al. Genome Res. 2008 18: 1638 -1642

После работы приборов MPSS получается примерно это… ? ? ?

Увы, на самом деле скорее вот это… биоинформатик за работой…

При недостатке солидарной ответственности Gen. Bank очень скоро рискует превратиться в нечто подобное…

Gene Expression Profile of Neuronal Progenitor Cells Derived from h. ESCs: Activation of Chromosome 11 p 15. 5 and Comparison to Human Dopaminergic Neurons William J. Freed et al. PLo. S ONE (www. plosone. org) 1 Jan 2008 Issue 1 e 1422

Светлое Будущее: Single Molecule Sequencing Systems Клональная амплификация исключается - последовательность считывается непосредственно с разнесенных в пространстве единичных молекул ДНК образца

Pacific Biosciences (Pac. Bio) недостаток - ограничения на длину чтения (диссоциация, время жизни полимеразы)

Pacific Biosciences RS II: up to 3000 nt / 2 h up to 30000 reads / run up to 90 Kb / run reagents ~ 1000$ / Gb read length up to 20000 (!) error rate > 10%

ABI (announced 2010 at SOLi. D Users Meeting) Достоинства: высокая точность (возможно повторное чтение), отсутствие явных ограничений длины; Недостаток: неявное ограничение длины глубиной резкости оптики и плотностью посадки ДНК, дороговизна(? );

Oxford Nanopore (promised in 2012) Достоинства: - нет ограничений длины; - не нужен затравочный комплекс (известный участок посл. - адаптер) - высокая точность (повторное чтение); - нет преобразования сигнала; - нет короткоживущих компонент;

Oxford Nanopore intends to commercialise the 'strand sequencing' system for DNA analysis during 2012 on both the Grid. ION and Min. ION. A single Min. ION is expected to retail at under $900 предварительная запись: http: //www. nanoporetech. com

2014: b-Testing https: //www. nanoporetech. com/technology/the-minion-device-a-miniaturisedsensing-system/the-minion-device-a-miniaturised-sensing-system

IBM “DNA Transistor” Technology Concept Feasibility Demonstrated Figure 4 Figure 5 Figure 6 ü Fabricated complex membrane-nanopore structures with metal electrodedielectric material sandwiches demonstrated – Prototype DNA transistor device with nanoscale Ti. N and Si. O 2 layers (4) – 3 nm pore drilled through metal-dielectric layered membrane (5) ü Electrophoretic ratchet feasibility was demonstrated through high-fidelity molecular dynamics simulations – showed ability to move DNA one base at a time (6) ü Licensed DNA sensing approaches from Arizona State and Columbia University www. 454. com

IBM “DNA Transistor” Technology Technical Details Figure 1. Figure 2. Figure 3. Достоинства: - нет ограничений длины; - высокая точность (повторное чтение); - нет преобразования сигнала; - нет короткоживущих частей; www. 454. com

Спасибо за внимание!

Пиросеквенатор “ 454 Life Sciences”