Этиология и молекулярная биология и туберкулеза Жданова Светлана

Этиология и молекулярная биология и туберкулеза Жданова Светлана Николаевна к. м. н. , с. н. с. лаборатории эпидемиологически и социальных инфекций НЦ ПЗСРЧ СО РАМН

Туберкулёз - хроническое инфекционное заболевание, вызываемое грамположительной бактерией Mycobacterium tuberculosis комплекс микобактерий туберкулеза (МБК): M. tuberculosis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti, M. canettii, M. pinnipedii, M. caprae n На М. t uberculosis приходится 98 -99% всех случаев туберкулеза легких и 80 -90% случаев туберкулеза всех видов

n n n Туберкулез - одна из серьезнейших проблем здравоохранения во всем мире Согласно оценкам ВОЗ на 2011 год, во всем мире насчитывается 16 -20 миллионов больных туберкулезом. число новых случаев заболевания ежегодно превышает 8 миллионов более 1. 8 миллиона человек умирает от ТБ. Большинство новых случаев и смертельных исходов заболевания приходятся на развивающиеся страны, где инфицирование часто происходит в детстве. В странах с высоким бременем болезни годовой риск инфицирования туберкулезом детей оценивается в 0. 5 -2%. Смерть детей обычно обусловлена туберкулезным менингитом или диссеминированной формой заболевания.

В глобальном масштабе заболеваемость ТБ населения зависит от: n n уровня социального обеспечения; географического положения

Число новых случаев в странах с наибольшим бременем ТБ в 2009 гг. 150 000 больных

Заболеваемость ТБ в РФ за 19852009 гг.

Главными причинами роста заболеваемости являются: n n n ухудшение социально-экономических условий жизни; рост числа социально-дезадаптированных групп населения; экологическая обстановка; перенаселенность; эпидемия ВИЧ; изменением патоморфоза туберкулезной инфекции

Эпидемическая обстановка в РФ за 2002 -2011 гг.

Заболеваемость туберкулезом на Европейской и Азиатской территориях России

Социально-экономический статус больных ТБ в России

Впервые выявленный туберкулез среди мужчин и женщин в РФ

Половозрастная структура туберкулеза в РФ

Причины смертности в РФ среди взрослого населения 30 -34 лет

Цикл развития туберкулеза от инфицирования организма микобактериями туберкулеза до клинических проявлений болезни n n n Распространение инфекции (инфицирование). Начало инфекции, пролиферация и диссеминация в инфицированном организме. Развитие иммунной реакции организма. Казеация (развитие казеозного некроза) и ускоренное размножение МБТ. Вторичное распространение инфекции (способность инфицировать, заражать).

Распространение инфекции n n n Больной туберкулезом продуцирует аэрозоли, в которых содержатся МБТ. Мелкие частицы аэрозоля высыхают и становятся пылевыми частицами. Пылевые частицы, содержащие микобактерии, вдыхаются человеком. Частицы проникают через бронхи и скапливаются в альвеолах. Микобактерии поглощаются альвеолярными макрофагами неиммунизированного организма. Если альвеолярные макрофаги способны уничтожить МБТ, инфекция не развивается.

Начало инфекции, пролиферация и диссеминация n n n n МБТ выживают и размножаются в альвеолярных макрофагах. Размножающиеся МБТ убивают альвеолярные макрофаги, макрофаги распадаются, высвобожденные хемокины и МБТ взаимодействуют с новыми клетками. Вновь сформированные макрофаги и моноциты захватывают и переваривают МБТ. Киллерные клетки и Т-лимфоциты начинают накапливаться в поврежденных участках. МБТ продолжают размножаться, убивая клетки макроорганизма, и распространяться локально (в участке своего первоначального внедрения). МБТ транспортируются во внутригрудные лимфатические узлы, откуда распространяются в системные органы.

Развитие иммунного ответа макроорганизма Развитие туберкулезного процесса в течение 3 -го этапа может происходить в двух вариантах. n Вариант 3. 1. У большинства пациентов в течение 3 -го этапа появляется достаточная устойчивость, чтобы подавлять развитие туберкулеза на протяжении всей жизни. n 3. 1. 1. Размножение МБТ останавливается, а их количество резко уменьшается. n 3. 1. 2. Первичный фокус и его дочерние фокусы оставляют после себя минимальные остаточные проявления. n 3. 1. 3. Туберкулиновый кожный тест становится положительным.

n n Вариант 3. 2 (неблагоприятный). При недостаточно активной иммунной реакции происходит прогрессирование туберкулезного процесса. Оно чаще наблюдается среди ВИЧинфицированных, детей, а также у лиц, предрасположенных к туберкулезу. У некоторых пациентов возникает реактивация скрытой туберкулезной инфекции. Реактивация может происходить вне легких или в самом легком и закончиться тканевым повреждением, формированием полости распада и вторичным размножением МБТ.

На клеточном уровне неблагоприятный вариант 3 -го этапа характеризуется процессами: n n Макрофаги передают туберкулезные антигены Тлимфоцитам; Т-лимфоциты высвобождают цитокины. Цитокины стимулируют продуцирование и активацию макрофагов. В результате формируется защита от повреждения клеток и тканей. Указанные реакции ограничивают быстрое размножение и/или уничтожают МБТ, заканчиваются формированием первичного легочного фокуса. Если макроорганизм не способен создать эффективную защиту от МБТ, первичный очаг прогрессирует.

Казеация и ускоренное размножение МБТ n n Туберкулезный фокус в легком реактивируется, подвергается некротизированию (казеации) с последующим формированием полости. В этот период МБТ, находящиеся во внеклеточном пространстве, размножаются экспоненциально.

Латентный туберкулез является n n следствием неразвившейся первичной инфекции, при которой МБТ продолжают оставаться в организме; результатом незаконченного процесса после перенесенного туберкулеза.

ТУБЕРКУЛИНОДИАГНОСТИКА n n n Туберкулинодиагностика – диагностический тест. Она указывает на наличие специфической сенсибилизации организма, обусловленной вирулентными МБТ или вакциной БЦЖ. Туберкулин - водно-глицериновый экстракт из бульонной культуры туберкулезных бактерий. Туберкулин не обладает полными антигенными свойствами, т. е. не сенсибилизирует здоровый организм и не вызывает образования противотуберкулезного иммунитета. туберкулеопротеин. антиген А 60. Туберкулин вызывает ответную реакцию только у людей, предварительно сенсибилизированных МБТ или вакциной БЦЖ. На месте внутрикожного введения туберкулина через 24 -48 ч развивается специфическая аллергическая реакция замедленного типа в виде формирования инфильтрата -отек всех слоев кожи с мононуклеарной и гистиоцитарной реакцией. Эта реакция характеризует степень аллергии — изменение чувствительности или реактивности организма на туберкулин, но не является мерой иммунитета.

Определение размера инфильтрата через 72 ч после введения туберкулина n n n Отрицательные – отсутствие инфильтрата или его размер 0 -1 мм. слабоположительные — размер инфильтрата 5 -9 мм; средней интенсивности — 10 -14 мм; выраженные — 15 -16 мм; гиперергические — к таким реакциям у детей и подростков относят реакции с диаметром инфильтрата 17 мм и более, у взрослых — 21 мм и более, а также везикулонекротические реакции независимо от размера инфильтрата с лимфангоитом или без него; - усиливающиеся — реакцией на туберкулин считают увеличениеинфильтрата на 6 мм и более по сравнению с предыдущей реакцией.

Пути передачи туберкулезаной инфекции n n n n аэрогенный, алиментарный, контактный и внутриутробный. Основной путь - аэрогенный. Источником распространения инфекции являются больные туберкулезом легких. Аэрозольная взвесь мокроты, может несколько часов сохраняться в воздухе. Передача заболевания происходит при вдыхании человеком зараженного микобактериями туберкулеза воздуха. Обычно заражение происходит в помещениях. Каждый больной бактериовыделитель, не получающий лечения, может инфицировать от 10 до 15 человек в год.

Другие пути заражения МБТ n n Вероятность заражения человека алиментарным путем в 10 тыс. раз меньше, чем при аэрогенном пути. Возможно при употреблении в пищу мясных и молочных продуктов, инфицированных М. bovis (плохо проваренного мяса, некипяченого или непастеризованного молока). Контактный путь передачи туберкулеза через поврежденные кожные покровы. Внутриутробный путь заражения встречается крайне редко и связан со специфическими поражениями плаценты и родовых путей женщин с диссеминированным туберкулезом или аспирацией новорожденным инфицированных околоплодных вод.

М. bovis n n n Во многих развивающихся странах М. bovis является распространенным источником заболевания крупного рогатого скота. Передача людям бычьего вида микобактерии в основном происходит через инфицированное молоко; обычно поражаются другие органы, помимо легких (внелегочный ТБ). Пастеризация молока обеспечивает тепловую инактивацию М. bovis (и Mtb) и прерывает, таким образом, алиментарный путь передачи. Передача туберкулеза, вызываемого дикой М. bovis, от человека маловероятна. Вновь появился кожный туберкулез, главным образом, в качестве проявления системной инфекции, вызванной Mtb, M. bovis или БЦЖ у. ВИЧ-коинфицированных пациентов.

Патогенез ТБ n n n n n Первичное заражение происходит при вдыхании частиц аэрозольной взвеси, содержащих МБТ. Минуя защитный слой слизи и реснитчатого эпителия бронхов и оседают в альвеолах легких. Инфекционный процесс начинается с размножения микобактерии в легких и приводит к формированию пневмонического очага. По лимфатическим путям МБТ попадают в лимфатические узлы средостения. Пневмонический участок в легких и региональный лимфаденит образуют первичный туберкулезный комплекс, откуда с кровотоком МТБ разносятся в органы и ткани. У лиц с нормальным иммунным ответом размножение МБТ будет остановлено, однако часть из них может существовать латентно. У лиц с ослабленным иммунитетом происходит размножение МБТ, и через несколько месяцев развивается первичный туберкулез. Вторичный туберкулез может возникнуть через несколько лет после инфицирования МБТ в результате реактивации старого туберкулезного очага или реинфекции (повторного заражения лиц, уже перенесших первичную инфекцию). туберкулез может поражать любые органы и ткани, но чаще всего (в 80 -85% случаев) страдают легкие.

М. tuberculosisвызывает как клеточный, так и гуморальный иммунные ответы n n n Гуморальный Эти ответы могут быть защитными или патогенными в зависимости от специфичности и функции активированных Т-клеток. Защита от болезни ассоциируется с ответом Т-клеток в виде Thl, включающего гамма-интерферон (IFN) продуцирующего CD 4+ Тклетки. Гамма-интерферон активирует макрофаги. Mtb, стимулируя продуцирование цельной кровью IFN, является на сегодня показателем, который наиболее тесно ассоциируется с защитой. Основной комплекс тканевой совместимости класса I, ограниченный CD 8+ Т-клетками, выполняет важную роль в обеспечении защитного иммунного ответа.

n n Развитие ТБ связывают с реакцией в виде Th 2 или смешанных Thl-Th 2 Т-клеток. Обычно мощная обусловленная Т-клетками гиперчувствительность замедленного типа приводит к гибели инфицированных макрофагов и также вызывает обширный некроз тканей хозяина. Выделение противовоспалительных цитокинов в ответ на антигены Mtb может подавлять иммунный ответ и ограничивать вызываемое Th 2 поражение тканей.

Бацилла Кальметта—Герена при микроскопическом увеличении (БЦЖ, Японский субштамм). Окрашивание по методу Циля — Нельсена. Маштаб увеличения: 1, 000

Вакцина БЦЖ n n обладает доказанным защитным действием в отношении туберкулезного менингита и диссеминированного ТБ среди детей. Она не предотвращает первичного инфицирования и, что более важно, не предотвращает реактивацию латентной легочной инфекции, являющейся основным источником бациллярного распространения среди населения

Mycobacterium tuberculosis n n n грамположительные кислото- и спиртоустойчивые бактерии аэробы и мезофилы неподвижны не образуют спор и капсул размножаются медленным клеточным делением

Особенности микроорганизмов МБК 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. внутриклеточный характер патогенеза. относительно низкий уровень внутривидовой генетической изменчивости. способность находиться в латентном состоянии. медленная скорость роста возбудителей. высокая плотность (концентрация) клеток М. tuberculosis в пораженном органе – до 10 млрд на легкое; способность клеток к переходу в фазу отсутствия роста с реактивацией через несколько лет. природная устойчивость ко многим антибиотикам. лекарственная устойчивость связана не с R-плазмидами (в отличие от большинства прокариот), а с IS-элементами. отсутствие экзотоксинов. признаки инфицирования проявляются в виде реакции на туберкулин. значимое предпочтение в использовании аминокислот ala, gly, pro, arg и trp, и сравнительно меньшую частоту использования аминокислот, таких, как asp, lys, phe и tуr

Состав многослойной клеточной стенки n n Липосахариды (с их фосфатидной фракцией связывают вирулентность микобактерии - корд-фактор), Поверхностно-активные липиды (сульфолипиды) образуют вместе с липополисахаридами цитотоксические мембранотропные комплексы. Специфичные воска (микозиды) защищают микобактерию от воздействий внешней среды, вызывают образование гранулем и обладают антигенными свойствами. Липоарабиноманнан неспецифически подавляет активность Т-лимфоцитов и других лейкоцитов

Геном Mycobacterium tuberculosis – возбудителя туберкулеза

Геном M. tuberculosis очень консервативен n n n Гомология ДНК M. tuberculosis достигает 85— 100 %, Геном M. tuberculosis меньше, чем у других микобактерий, содержит 4 411 529 пар нуклеотидов, 65, 6% которого составляют гуанин и цитозин. Имеет гены, многократно дублирующие ключевые ферментные системы (ацил-Со. Асинтаза и ацил-Со. А-дегидрогеназа – участники липидного обмена, в производстве которых участвуют 36 различных генов)

Общее количество генов в геноме штамма М. tuberculosis H 37 Rv составляет 4267 n n - Более 51% генов возникли в результате дупликации и перемещения доменов. Из 4000 генов, кодирующих белки, 60 кодируют функциональные компоненты РНК: уникальный рибосомальный РНК оперон, 10 S РНК, участвующий в деградации белков с нетипичной матричной РНК, РНК компонент фермента РНК-азы Рибозим, который принимает участие в метаболизме т. РНК , 45 транспортных РНК, около 100 липопротеинов.

Причины медленного роста МБТ n n n высокое процентное содержание GC, что отражается наличием инициаторных кодонов GTG в 35%, Оперон (целостно транскрибируемая группа функционально родственных генов) рибособальной РНК (rrn) представлен в единичном экземпляре и располагается необычно «далеко» от предполагаемого начала репликации ori. C (участок, где начинается репликация) значительная часть кодирующей ёмкости генома (около 9%) направлена на производство ферментов липогенеза и липолиза.

За вирулентность микобактерий туберкулеза ответственны: n n n ферменты каталаза и пероксидаза, нейтрализующие действие активного кислорода, который продуцируют фагоциты; ген mce, кодирующий макрофагколониобразующий фактор и sigma-фактор sig A (aka rpo. V), мутация которого может привести к ослаблению жизнеспособности бактерий, ее клеточной стенки. фосфолипаза С, липаза и эстераза — ферменты, атакующие клеточные и вакуолярные мембраны тканей человека.

М. tuberculosis демонстрирует большое фенотипическое разнообразие популяции выявлять гены, ответственные за n n исследование полиморфизма генов и его сопоставление с фенотипическим разнообразием вида позволяет: n n n формирование вирулентности микроорганизма; проводить группировку штаммов по характерных генотипических чертам М. tuberculosis относить неизвестные изоляты к уже известной группе. выявлять филогенетические отношения между ними и изучать эволюционную историю данного вида на основе знания геномных структур штаммов и их принадлежности к определённой группе

Генетичеcкие элементы M. tuberculosis, определяющие полиморфизм ДНК n n n n IS 6110 IS 1081 PGRS-последовательности DR-последовательности MPTRs ETR MIRU

IS 6110 n n n В хромосоме M. tuberculosis Н 37 Rv - 56 копий ISэлементов, принадлежащих к семействам IS 3, IS 5, IS 21, IS 30, IS 110, IS 256, IS 13, IS 1535. Транспозон IS 6110, относящийся к семейству IS 3 , имеет длину 1361 н. п. является стабильным элементом. Содержит один сайт рестрикции Pvu. II, В составе хромосомы различных штаммов микобактерий туберкулёза, как правило, присутствует от 5 до 20 копий IS 6110 Различия в количестве копий и локализации используют для дифференциации штаммов МБТ.

n n Транспозон IS 1081 имеет длину 1324 н. п. и встречается в микобактериальных геномах - 5 -6 копий на геном. IS 1081 обладает меньшей, чем 1 S 6110, степенью полиморфизма. PGRSпоследовательности GC-богатые полиморфные последовательности - PGRS, входят в состав ряда генов, принадлежащих вариабельному генному семейству РЕ n

DR-последовательности DR-локус содержит различное число коротких прямых повторов длиной 36 н. п. , разделенных уникальными последовательностями (спейсерами) длиной от 34 до 41 н. п. n n Главный тандем повторений (MPTRs) это полимофная 10 -bp повторяющаяся последовательность, разделенная 5 -bpпоследовательностью.

ETR консервативные тандемные повторы (exact tandem repeats; - точное число повторов, ETR). Количество повторов в каждом локусе варьирует в зависимости от штамма. n MIRU В геноме М. tuberculosis обнаружен 41 рассеянный (по геному) повторяющийся элемент (mycobacterial interspersed repetitive units, MIRU)локус, но только 12 являются полиморфными в популяции и применимы в качестве маркеров n