Этиологическая диагностика Если число жертв

Этиологическая диагностика

• Если число жертв является показателем значимости болезни, тогда все болезни, особенно наиболее опасные инфекции – такие, как бубонная чума, азиатская холера и др. , должны остаться далеко позади туберкулеза. Роберт Кох, 1882

Классификация микобактерий - Семейство Mycobacteriaceae - Порядок Actinomycetales - Род Mycobacterium Комплекс Мycobacterium tuberculosis: M. tuberculosis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti, M. canettii, M. pinnipedii, M. caprae.

Классификация микобактерий - Типичные патогены: (микобактерии туберкулезного комплекса + M. leprae) - Условно патогенные микобактерии: (M. avium, M. intracellullare, M. xenopi, M. fortuitum, M. chelonae и др. ) - Сапрофитные микобактерии: (M. vaccae, M. flei, M. tarrae, M. gordonae, M. nonchromogenicum и др. )

Морфология возбудителя туберкулеза из материалов Ерохина В. В. • Электронно-микроскопическое исследование МБТ (фото 1) • КУМ при окраске по Цилль-Нильсену увеличение Х 1000 (фото 2) • Измененная МБТ в макрофаге из туберкулезной гранулемы (фото 3)

Группировка по комплексам • комплекс M. tuberculosis – микобактерии туберкулезного комплекса – это комплекс микобактерий, вызывающих туберкулез (M. tuberculosis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti, M. canetti), • комплекс M. avium (M. avium, M. intracellulare), • комплекс M. fortuitum, • комплекс M. terrae.

Лабораторная диагностика туберкулеза • прямые методы: - традиционные методы микробиологической диагностики (микроскопия, посев) и молекулярно-генетическая диагностика, позволяющая определять наличие возбудителя (или ДНК) в клиническом материале. • косвенные методы: - лучевые методы, фиксирующими последствия воздействия микобактерий на ткани органов пациентов; - определение иммунного ответа организма.

В первую очередь микроскопическому обследованию подлежат: • лица с явными клиническими симптомами заболевания, • контактировавшие с больными, имеющими положительный результат бактериоскопического исследования и соответствующие симптомы заболевания, • лица имеющие рентгенологические изменения в легких, подозрительные в отношении туберкулеза; • при активном обследовании лиц, входящих в группы риска по заболеванию туберкулезом.

Микроскопическая диагностика • Бактериоскопии мазка, окрашенного по Цилю-Нильсену (фото 1) • Люминесцентная микроскопия -метод основан на проникновении в микробную клетку карболового производного флюоресцентного красителя (аурамина, родамина) (фото 2).

Диагностическая отдача повторной микроскопии мазка среди больных с подозрением на легочный туберкулез в провинции Шандонг в Китае • • • 1 -я мокрота 2 -я 3 -я 4 -я 5 -я (5439) (5105) (4757) (4590) (4326) 84, 5 проц. пол. 12, 2 3, 2 0, 1 0 Wu Zl at all. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2000: 4. 1086

Диссеминированный микобактериоз (M. avium) у ВИЧ (+) пациента Клиника СПб. НИИФ

Культуральная диагностика • Жидкие среды: - Nokard (1887), Проскауэра - Бека (1894), Сотона (1912), Е. А. Школьниковой (1947), Middlbrook 7 Н 9 (1947), Дюбо (1952). • Твердые питательные среды на яичной основе: Левенштейна (1924 г. ), Йенсена (1932), С. И. Гельберга (1935), Огава (1949), Г. Г. Мордовского (1970), Э. Р. Финна № 1 и 2 (1973), а также Попеску, В. А. Аникина

В 1993 г. Центр контроля и профилактики заболеваний (CDC) рекомендовал каждой клинической лаборатории использовать жидкую среду вместе с плотной для выявления микобактерий. Установлено, что жидкая среда достоверно превосходит плотную в отношении выявления микобактерий, сроков, детекции и тестов на лекарственную чувствительность. Описаны случаи, когда определенные виды микобактерий растут только в жидкой среде (около 5 %). Tenover FC, Crawford JT, Huebner RE, et al. The resurgence of tuberculosis: is your laboratory ready? J Clin Microbiol. 1993; 31: 767 -770. Bird BR, Denniston MM, Huebner RE, et al. Changing practices in mycobacteriology: a follow-up survey of State & Territorial Public Health Laboratories. J Clin Microbiol. 1996; 34: 554 -559.

Автоматизированные системы культуральной диагностики. - BACTEC 460 TB (14 CO 2), BACTEC 9000, 9050, BACTEC MGIT 960, 320 (Becton-Dickinson) - MB/Bac. T ALERT 3 D (bio. Merieux) - Alarm Blue Assay - ESP Culture System (Trek Diagnostic Systems) - MB Redox tube (Biotest AG)

Система культуральной диагностики BACTEC MGIT 960

Бактериологическое выявление микобактерий Питательные среды Мидделбрук 7 Н 9 ЛЙ Визуальный ручной Способ детекции Флуорохромный автоматический Длительность теста 12 недель 6 недель Положительный результат С 21 дня С 4 дня Постановка теста ЛЧ 21 день 14 дней 1 ряд не включая 1 ряд, включая пиразинамид и 2 ряд

Определение лекарственной устойчивости НТМБ • - отсутствие референтных методов • - не определены критические концентрации (только минимальные ингибирующие концентрации) • - возможно использование системы: Sensititre (TREK Diagnostic System Ltd, UK)

Определение лекарственной устойчивости НТМБ • Лаборатории могут выдавать клиницисту результаты определения минимально ингибирующих концентраций НТМБ к различным лекарственным препаратам: изониазид(INH), рифампицин(RIF), рифабутин(RFB), этамбутол(EMB), моксифлоксацин(MXF), амикацин(AMI), линезолид(LZD), ципрофлоксацин(CIP), доксицинклин(DOX), этионамид(ETH), цефокситин(FOX), имипенем(IMI), цефепим(FEP), амоксиклав(AUG 2), цефтриаксон(AXO), миноциклин(MIN), тобрамицин (TOB).

Лекарственная устойчивость микобактерий туберкулеза • Первичная лекарственная устойчивость – это устойчивость, выявленная у штаммов, выделенных от никогда ранее не лечившихся от туберкулеза (или лечившихся в течение менее 1 месяца) больных до начала лечения. Распространенность устойчивости этого типа отражает уровень распространенности лекарственно устойчивых штаммов на данной территории. • Вторичная, или индуцированная, устойчивость, которая развивается в результате неэффективной химиотерапии и характеризует эффективность противотуберкулезных программ.

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ - 1985 год - первая публикация, в которой использован метод ПЦР Kary Mullis и соавторов. Saiki, R. K. , et al. , 1985. Enzymatic amplification of b-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia, Science 230, 1350. - 1989 год одна из первых публикаций использования ПЦР в диагностике туберкулеза Brisson-Noel A. et al. , 1989. Rapid diagnosis of tuberculosis of mycobacterial DNA in clinical samples. Lancet, 1989; 2: 1069 -1071. - 1993 год - Нобелевская премия в области химии Kary Mullis. - 1992 год - первая публикация Higuchi и соавторов, в которой использован метод ПЦР в реальном времени. Higuchi, R. , Dollinger, G. , Walsh, P. S. , Griffith, R. , 1992. Simultaneous amplification and detection of specific DNAsequences. Bio-Тechnology 10(4), 413– 417

Полимеразная цепная реакция Быстрый, простой, чувствительный и универсальный метод in vitro точной амплификации выбранных последовательностей ДНК/РНК из сложных комплексов нуклеиновых кислот

Преимущества Real-Time PCR (ПЦР РВ) • • Быстрый результат Применение для медленно плохо растущих микроорганизмов Высокая чувствительность и специфичность Количественный анализ Устойчивость к антибиотикам. Исключение после амплификационных манипуляций с продуктом, и существенное снижение риска контаминации, сокращение времени анализа, упрощение организации ПЦР лаборатории. Автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов.

Биочип для одновременного обнаружения возбудителя туберкулеза и выявления его лекарственной устойчивости ТБ-БИОЧИП (МДР) VAL 516 TYR 516 GLY 516 GLU 516 GLN 513 HIS 510 HIS 526 ASP 526 LEU 526 GLN 526 CYS 526 LEU 513 ILE 515 HIS 526 TYR 526 ASN 526 ARG 526 PRO 526 LYS 513 SER 522 LEU 522 SER 531 LEU 531 TRP 531 CYS 531 GLN 531 GLY 513 LEU 533 PRO 533 LEU 511 PRO 511 ARG 512 THR 512 SER 512 HIS 510 LEU 511 PRO 511 ARG 511 MET 515 ILE 515 IS 6110 SER 315 THR 315 (1) THR 315 (2) ASN 315 ILE 315 ARG 315 (1) ARG 315 (2) GLY 315 TRP 328 GLY 328 LEU 328 CYS 328 ILE 335 VAL 335 inh. A T(24) inh. A W(G 24) ahp. C W(G 6) ahp. C A(6) inh. A G(16) inh. A T(15) inh. A W(C 15) inh. A G(8) inh. A A(8) inh. A W(T 8) ahp. C W(C 10) M ASP 516 GLN 510 Зона анализа ИЗН- устойчивости Del 507 MET 515 Зона анализа РИФ- устойчивости Del 507 N GLN 510 M ahp. C T(10) ahp. C A(10) ahp. C W(G 9) ahp. C A(9) ahp. C W(C 12) ahp. C T(12) IS 6110 M IS 6110 зонд

3 -х мерный биологический наночип (Биочип, Microarray) 80 микрон Схема чипа Макро. Фото (х10) БИОЧИП – множество иммобилизованных (ковалентно связанных) с твердой фазой (стеклянная подложка, гель, мембрана, кремниевая пластина) биологических макромолекул (короткие и длинные фрагменты ДНК, белки), химических лигандов или клеток.

Гибридизация молекул на биочипе Сигнал при несоответствии при соответствии зонда на биочипе и меченой пробы Меченая проба Иммобилизованный зонд на биочипе

Отчет исследования мутаций в клиническом материале (мокрота)

ТБ-БИОЧИП-2 для определения лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis к резервным химиопрепаратам Устойчивость к фторхинолонам обусловлена мутациями в гене gyr. A, Кодирующем ά- субъединицу ДНК-гиразы Штамм «Дикого типа» Штамм, устойчивый к офлоксацину Arg 95 > Thr Лаборатория молекулярно-генетических методов СПб. НИИФ

Hain-test MDR-TB Мультиплексная полимеразная цепная реакция; гибридизация на бумажных стрип-полосках M+ Чувств. МБТ Inh Rif MDR 99 94 99 98 Специф. 99 99 99 100

Geno. Type® MTBDRsl gyr. A – ген ДНК-гиразы: устойчивость к фторхиолонам rrs – ген 16 S р. РНК: устойчивость к аминогликозидам, циклическим пептидам emb. B – ген субъединицы арабинозил трансферазы: устойчивость к этамбутолу

Интерпретация результатов Лаборатория молекулярно-генетических методов СПб. НИИФ

Тесты HAIN для определения видов НТМ The Geno. Type Mycobacterium CM (Common Mycobacteria) основывается на DNA • STRIP технологии и позволяет идентифицировать следующие виды микобактерий: M. avium ssp. , M. chelonae, M. abscessus, M. fortuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. interjectum, M. kansasii, M. malmoense, M. peregrinum, M. marinum/M. ulcerans, M. tuberculosis complex and M. xenopi The Geno. Type Mycobacterium AS (Additional Species) основывается на DNA • STRIP технологии и позволяет идентифицировать следующие виды микобактерий: M. simiae, M. mucogenicum, M. goodii, M. celatum, M. smegmatis, M. genavense, M. lentiflavum, M. heckeshornense, M. szulgai/M. intermedium, M. phlei, M. haemophilum, M. kansasii, M. ulcerans, M. gastri, M. asiaticum, and M. shimoidei

Система Gene. Xpert – ПЦР лаборатория в картридже (Cepheid) - - - Полностью автоматизированная подготовка проб для амплификации, Мультиплексная ПЦР в реальном времени, Независимые модули, Время подготовки проб- 15 минут, Время до получения результата – 2 часа, Автоматическая оценка результатов, Одновременная детекция микобактерий и определение резистентности к рифампицину.

Простая обработка образца - мокрота 4. Добавить 2 мл обработанной клинической пробы в картридж 2. Перемешать и оставить на 10 мин. 1. Добавить буфер в отношении 2: 1 3. Перемешать и Оставить ещё на 5 мин Начать тест…