Эпигеномная регуляция процессов эбрионального развития млекопитающих
Случайная инактивация Х-хромосомы – “черепаховая” окраска у кошек Случайная инактивация Х-хромосомы: Различная окраска клонированной и исходной кошки
Компенсация дозы: как происходит инактивация второй Х-хромосомы в эмбриогенезе мыши?
Механизм инактивации второй Х-хромосомы Тельце Барра: инактивация одной из Х-хромосом в клетках ХХ эмбриона
Центр инактивации Х-хромосомы (Xic) В центре инактивации Xic расположен ген Xist (X-inactive specific transcript), продуктом которого является функциональная РНК, которая на ранних этапах инактивации необходима и достаточна для «выключения» генов Х-хромосомы. Активность гена Xist негативно регулируется геном Tsix. Эти гены частично перекрываются между собой (каждая цепь участка двуцепочечной ДНК несет свою информацию) что отражено в названии последнего - Tsix, это Xist наоборот. Помимо этих двух генов в центре инактивации обнаружено еще 9 генов, для которых роль в процессе Х-инактивации пока не до конца ясна В 1963 году С. Растан с соавторами предсказали существование на Х-хромосоме района, отвечающего за инактивацию прилегающих участков хромосомы – центра инактивации Хic. Это предположение было сделано на основании того, что при встраивании некоторых фрагментов Х-хромосомы в состав неполовых хромосом (аутосом) происходит выключение примыкающих к месту интеграции аутосомных генов. По-видимому, такая «гибридная» хромосома, несущая центр инактивации Xic, воспринимается клеткой как еще одна Х-хромосома и учитывается при «расчете» дозы генов. Таким образом, центр инактивации Xic является «визитной карточкой» Х-хромосомы для систем клетки. Центр инактивации Xic содержит элементы, отвечающие за подсчитывание всех Ххромосом (центров Xic), а так же за выбор будущей единственной активной Х-хромосомы. Делеция элементов, ответственных за выбор, приводит к преимущественной инактивации Ххромосом с интактным центром Xic, а повреждение счетных элементов центра Xic вызывает инактивацию единственной Ххромосомы в клетках с кариотипом Х 0 и ХY. http: //www. bionet. nsc. ru/labs/epigenetics/? page_id=304
Возможные механизмы инактивации второй Х-хромосомы “Импринтированная” “Случайная? ” • В ХХ эмбрионах инактивируются все Ххромосомы, кроме одной (у тетраплоидных мышиных эмбрионов выключаются 3 из 4 -х Ххромосом). Почему? • В ХУ эмбрионах не выключается единственная Х-хромосома В Х-хромосоме, полученной от матери, есть Теория “блокирующего фактора” импринт, блокирующий экспрессию Xist, (но Есть некий фактор (неизвестной природы), не за счет метилирования). Этот импринт, который связывается с Х-хромосомой в зоне Хic и вероятно, связан с модификациями гистонов блокирует экспрессию гена Xist. Разные аллели Xic и устанавливается во время созревания имеют разное сродство к этому фактору. Если ооцитов. аллель одна, то фактор связывается с ней (нет В Х-хромосоме, полученной от отца, в конкуренции) и Хist инактивируется. области промотора Xist есть “Или неслучайная? ” низкометилированные Ср. G-участки, • Влияние Tsix: делеции в промоторе Tsix деметилирование в них происходит во время приводят к предпочтительной инактивации этой сперматогенеза. хромосомы. Вероятно, образование Xist-Tsix (по принципу сенс-антисенс) двуцепочечных РНК • У сумчатых – Х-инактивация • В реконструированный ХХ эмбрионах (2 только по принципу импритига отцовских или 2 материнских пронуклеуса – так (всегда выключена отцовская Xназываемые андрогенетические и хромосома) гиногенетические эмбрионы) нарушаются • У мыши – в ТЭ и ПЭ – паттерны инактивации Х-хромосом импритинг, остальные ткани – • У мышей на Х-хромосоме есть локус Xce (Хcontrolling element). Его аллели влияют на случайный механизм вероятность того, инактивируется эта хромосома • У человека? или нет. • В ХХ эмбрионах в ТЭ и ПЭ всегда выключаются отцовская, но не материнская Х-хромосома • Но почему в ХУ эмбрионах не выключается единственная Х-хромосома?
Модель регуляции активности Xist/Tsix участка в раннем эмбриогенезе мыши (A) In the preimplantation embryo, the segregation of PIC together with H 3 -K 4 dimethylation over the paternal and maternal Xist and Tsix promoters ensures paternal Xist and maternal. Tsix expression, respectively. Bold arrows represent high levels of expression, dotted arrows represent low levels of expression. (B) At the implantation stage, an unknown ICMspecific repressive mechanism of PIC recruitment at P 1 Xist promoter avoids biallelic X-inactivation (represented by a question mark and a transparent PIC at the Xist promoter). In the meantime, biallelic Tsix activation erases the histone methylation pattern by inducing high levels of H 3 -K 4 dimethylation across the region (pink arrows), rendering both Xist alleles epigenetically equivalent. (C) At the onset of random X-inactivation, monoallelic down-regulation of Tsix results in an increase of H 3 -K 4 dimethylation over the corresponding Xist promoter region. The absence of ICM-specific Xist repression allows stable binding of the transcriptional apparatus, inducing high levels of monoallelic Xist expression and Xinactivation. (D) In the female epiblast, other epigenetic marks lock in the expression profile of Xist and the silencing of Tsix transcription.
“Регуляторы громкости” для генов: 1) Информация о работе генов заключена не т олько в последовательности ДНК. 2) Роль регуляторов громкости, усиливающих или ослабляющих действие генов, выполняют эпигенетические факторы. 3)Носителями эпигенетической информации служат химические группы, связанные с ДНК или гистонами, регулирующими упаковку ДНК в составе хромосом 4)Модификация белков обеспечивает более краткую эпигенетическую регуляцию, модификация ДНК – более длительную
Наследование уровня метилирования в ряду поколений клеток Метилирование ДНК осуществляется ДНК-метилтрансферазами 1. Это обычный фрагмент молекулы ДНК, за тем исключением, что цитозин здесь прометилирован: 5'-ACGTAT 5 -Me. CGT-3' 3'-TGCATAG 5 -Me. CA-5' 2. Репликация ДНК: метилированность сама по себе не реплицируется, временная пассивная деметилизация ДНК 5'-ACGTAT 5 -Me. CGT-3' 3'-TGCATAGCA-5' 5'-ACGTATCGT-3' 3'-TGCATAG 5 -Me. CA-5‘ 3. Метилирование цитозина поддерживающей метилазой в паре 3'-GC-5' (метилирование цитозина производится только в том случае, если напротив 3'GC-5' в комплементарной цепи ДНК есть 5'-CG-3' с прометилированным C). 5'-ACGTAT 5 -Me. CGT-3' 3'-TGCATAG 5 -Me. CA-5' Таким образом, модифицированный цитозин может наследоваться подобно обычному, передавая свою метилированность в дочернюю цепь ДНК.
Во время оплодотворения: в отцовском геноме происходит деметилирование и замена протаминов на гипометилированные гистоны; материнский пронуклеус – сильнее метилирован и содержит ацетилированные гистоны
Эпигенетическое наследование – геномный импритинг Геномный импринтинг - это эпигенетический процесс, дифференциально маркирующий материнские и отцовские гомологичные хромосомы и приводящий к разному фенотипическому проявлению мутаций у потомства, унаследованных от матери или отца. (от “imprint” — отпечаток) Когда в соматических клетках проявляется изменение транскрипционной активности импринтированного гена в зависимости от его происхождения (материнский или отцовский), то говорят об “эпиаллеле”
Пример эпигенетического наследования доминантного признака: 1) 2) 3) 4) 5) 20 лет назад родился баран с массивной задней частью, ему дали кличку “чистое золото” 50% его потомков в поколении F 1 наследовало признак (т. е. это доминантная мутация) При скрещивании F 1, несущих мутацию, ценный признак передали потомкам только отцы При скрещивании самки F 1 признак проявляется только у ее внуков. Животные, получившие мутантный ген от матери, имеют нормальный фенотип, вне зависимости, какой ген они получили от отца 1 2 3 4
Динамика метилирования ДНК половых и соматических клеток в ходе раннего развития эмбриона 1 — импринтированные гены; 2 — неимпринтированные материнские гены; 3 — неимпринтированные отцовские гены Тканеспецифичное метилирование цитозиновых остатков ДНК у млекопитающих осуществляется с помощью нескольких вариантов ферментов — ДНКметилтрансфераз (Dnmts) — Dnmt 1, Dnmt 2, Dnmt 3 A, Dnmt 3 В и Dnmt 3 L, — отличающихся по своим функциям: Dnmt 3 A и 3 B — необходимы для метилирования ДНК de novo в эмбриональных стволовых клетках и в ходе эмбриогенеза; Dnmt 1 поддерживает специфический рисунок метилирования в размножающихся клетках. 1) рисунки метилирования ДНК в клетках организма обладают пространственной, временной и тканевой специфичностью; 2) специфика метилирования ДНК наследуется дочерними клетками; 3) специфические метки метилирования (отпечатки) стираются в примордиальных половых клетках; 4) в ходе созревания в половых клетках происходит восстановление рисунков метилирования в соответствии с половой принадлежностью организма; 5) после слияния половых клеток в преимплантационных эмбрионах происходит деметилирование генома, а в ходе дальнейшего развития зародыша — de novo метилирование ДНК соматических клеток; 6) активные гены в клетках не метилированы; 7) в случае метилирования промоторов генов отмечается подавление их экспрессии.
Механизмы развития синдромов Прадера - Вилли и Ангельмана. • склонность к перееданию (ожирение); • пониженный мышечный тонус (гипотонус); пониженная координация движений; • маленькие кисти и стопы, низкий рост; • повышенная сонливость; • косоглазие; сколиоз; пониженная плотность костей; гипогонадизм (бесплодие); • речевая задержка, задержка психического развития; • более позднее половое созревание. • проблемы с питанием, плохо набирают вес; • задержка в развитии навыков общей моторики (умение сидеть, ходить); • задержка речевого развития, неразвитая речь • гиперактивность; • эпилепсия; • ходьба на негнущихся ногах — из-за этой особенности детей с этим синдромом иногда сравнивали с марионетками • нарушения сна; • косоглазие в 40 % случаев; • сколиоз в 10 % случаев; • повышенная чувствительность к высокой температуре;
Геномный импритинг и однородительские дисомии Заболевания человека, этиологически связанные с однородительскими дисомиями Фенотипический эффект ОРД по какой-либо хромосоме набора выявляется лишь в том случае, если эта хромосома несет импринтированные локусы
Ошибки расхождения хромосом в мейозе: численные хромосомные нарушения http: //atlasgeneticsoncology. org/Educ/Poly. Meca. Eng. html
T. Frumkin et al. / Molecular and Cellular Endocrinology 282 (2008) 112– 119
Противоположно импринтированные гены H 19 и IGF 2 регулируются координированно благодаря конкуренции их промоторов за доступ к общему энхансеру Синдром Беквита-Видемана: http: //www. beckwith-wiedemann. info/protocol_russ. html • ОРД по сегменту 11 р15. 5 отцовского происхождения приводит к двойной дозе гена IGF 2, • мутация в материнском аллеле, при котором активируется IGF 2 - тот же эффект материнский аллель не метилирован На хромосоме матери энхансер активирует транскрипцию гена H 19, с которого считывается нетранслируемая РНК, а ген IGF 2 находится в неактивном состоянии. На хромосоме отца в результате метилирования локуса H 19 ген IGF 2 становится доступным для энхансера и активируется.
Время возникновения импринтирования локуса IGF 2 -H 19 и IGF 2 R: • Геномный импритинг отсутствует у однопроходных млекопитающих (эволюционная дистанция с териями – 180 млн. лет) • Геномный импритинг обнаруживается у сумчатых и плацентарных млекопитающих (эти группы разошлись 150 млн. лет назад) http: //ls-space. blogspot. com/2008/07/047 -evolutionary-origin-of-mammalian. html
Соотношение экспрессии разных аллелей генов H 19, IGF 2 and IGF 2 R в плаценте человека (ворсинки хориона) Для анализа экспрессии Н 19 и IGF 2 использовали ворсинки хориона плодов гетерозиготных по SNP (т. е. несущих разные аллели) Buckberry S, Bianco-Miotto T, Hiendleder S, Roberts CT (2012) Quantitative Allele-Specific Expression and DNA Methylation Analysis of H 19, IGF 2 and IGF 2 R in the Human Placenta across Gestation Reveals H 19 Imprinting Plasticity. PLo. S ONE 7(12): e 51210. doi: 10. 1371/journal. pone. 0051210 http: //www. plosone. org/article/info: doi/10. 1371/journal. pone. 0051210
Placental methylation levels in regions upstream and covering the H 19 transcription start site (TSS). Buckberry S, Bianco-Miotto T, Hiendleder S, Roberts CT (2012) Quantitative Allele-Specific Expression and DNA Methylation Analysis of H 19, IGF 2 and IGF 2 R in the Human Placenta across Gestation Reveals H 19 Imprinting Plasticity. PLo. S ONE 7(12): e 51210. doi: 10. 1371/journal. pone. 0051210 http: //www. plosone. org/article/info: doi/10. 1371/journal. pone. 0051210
Upstream effectors of the H 19 gene expression is modulated when tissues undergo repair and differentiation, and are subjected to carcinogens, cytokines, growth factors and stress conditions. H 19 gene expression is also modulated by p 53 transcription factor and HGF/SF stromal factor
Modulation of gene expression linked to invasion and angiogenesis by H 19 RNA. A reduced expression of adhesion molecules responsible for cell-cell and cell-matrix interactions together with the up regulation of genes required for extracellular-matrix metabolism, motility, and angiogenesis put H 19 gene function in the core of at least the initial steps of metastatic cascade.
РНК-интерференция (RNAi) Фермент Dicer разрезает двуцепочечную РНК. При этом образуются si. RNA (защита от РНКвирусов) или micro. RNA (получается из собственной РНК-предшественника). Эти процессированные РНК попадают в RISC (RNA-induced silencing complex), который разрушает м. РНК и предотвращает трансляцию. Собственные интерферирующие РНК: 1) ми. РНК (Micro. RNA) - пост транскрипционный сайленсинг (глушение) гена 2) пи. РНК (Piwi-interacting RNA) – управляют уровнем метилирования ДНК (у млекопитающих)
Манипуляции с гаметами и эмбрионами Стресс Апоптоз и фрагментация Модификация экспрессии генов Нарушение компактизации Изменение кинетики развития Нарушение соотношения ВКМ и трофэктодармы Нарушение соотношения фетальных и плацентарных тканей Изменение метаболизма Асинхрония эмбриона и материнских тканей Изменение метаболизма плода и/или плаценты Аборт Нарушение роста и развития эмбриона
Овца Долли 1996 -07 -05 - 2003 -02 -14 Долли с ягненком http: //en. wikipedia. org/wiki/Dolly_the_Sheep
Мышь Кумулина донор ооцитов донор ядер Источник ядер донора – клетки кумулюса суррогатная мать клон фолликул Гавайский университет 1997 год
Цена клонирования Было создано 1095 реконструированных эмбрионов Они были пересажены Щенок Снуппи – первый клон собаки и Афган - афганская борзая, из клеток которого он был клонирован (Южная Корея, 2005 г. ) 123 суррогатным матерям Развились 3 эмбриона: погиб во время беременности родился мертвым Снуппи
Эффективность клонирования – обзор данных на 2010 г. Lorthongpanich, Solter, Lim, 2010
Синдром генерализованного чрезмерного роста клонированных мышей Dr. Ryuzo Yanagimachi, University of Hawaii Genetically identical mice: the obese on the right is the clone. Профиль экспрессии у новорожденных клонированных мышей: нарушения в 4 -5% генома, но в 30 -50% импринтированных генов Эпигенетические нарушения у клонированных эмбрионов: • Аномальное метилирование ДНК: в норме во время дробления проходит глобальное деметилирование и происходит активация “генов плюрипотентности”, в том числе Осt-4 • Аномальный импритинг, дисрегуляция генов, нарушение структуры хроматина • Синдром крупного потомства • Преждевременная гибель
Клонирование клонов • Клонированные животные живут меньше, чем обычные. • По некоторым данным, в клетках клонов укороченные теломерные участки. Чтобы проверить, сократиться ли срок жизни клонов при повторном клонировании в яйцеклетки пересадили ядра из клеток клонов. При таком последовательном клонировании происходила коррекция длины теломер Телята полученные из клеток клонированных коров в Японии (2000 г. ) и Бразилии (2004 г. )
История открытий в области репрограммирования ядер Three approaches to nuclear reprogramming are described: nuclear transfer (blue), cell fusion (pink) and transcription-factor transduction (green). These complementary approaches have provided synergistic insights for almost 50 years and continue to inform the understanding of nuclear reprogramming and influence medical advances. EG cell, embryonic germ cell. Nature 465, 704– 712 (10 June 2010) doi: 10. 1038/nature 09229
Клонирование: репрограммирование ядер терминальнодифференцированных клеток путем создания линии ЭСК
Как повысить эффективность клонирования? Два разных подхода к получения клонированных эмбрионов: Прямое клонирование пересадка клонированной бластоцисты Успех 50% Успех -1 -2% Непрямое клонирование: из клонированной бластоцисты выращивают культуру ЭСК и их ядра используют для клонирования новых эмбрионов Эффективность обеих методик низкая, но во втором случае можно сделать сотни попыток….
Как повысить эффективность клонирования? Наибольшая эффективность – при совмещении технологии пересадки соматического ядра и технологии создания аллофенных химер.
Клонирование с использованием “неподходящих” источников ядер
Трансгенные клонированные свиньи, продуцирующие интегрины (белки клеточной адгезии) человека. “Гуманизированные” животные Staunstrup NH et al. , Development of transgenic cloned pig models of skin inflammation by DNA transposon -directed ectopic expression of human β 1 and α 2 integrin. PLo. S One. 2012; 7(5).
Три подхода к возвращению дифференцированным клеткам плюри/тотипотентности Nature 465, 704– 712 (10 June 2010) doi: 10. 1038/nature 09229
Молекулярные основы неудач при клонировании приматов: после переноса ядра соматической клетки в яйцеклетку приматов нарушения в формировании веретена деления приводят к развитию анеуплоидных эмбрионов Масштабный отрезок – 10 мкм C. Simerly et al. , Science 300, 297 (2003) (A) Дефектное веретено деления с неправильно расположенными хромосомами после пересадки соматического ядра. Центросомальный белок митотического аппарата Nu. MA в норме в процессе мейоза (B) и митоза (C), отсутствует в веретене деления после переноса ядра (D). После переноса ядра соматической клетки отсутствует центросомальный белок HSET (E), но присутствует белок Eg 5 в центромерах. (F). Биполярные веретена деления с правильно расположенными хромосомами и центросомальным белком Nu. MA после переноса соматического ядра в оплодотворенные яйцеклетки (G). Голубой - ДНК; красный -тубулин; зеленый - Nu. MA на рис. (B), (C), (D) и (G), HSET – на рис. (E), и Eg 5 – на рис. (F).
Южнокорейский ученый Ву Сук Хванг в 2004 году сообщил о получении человеческих стволовых клеток из клонированных эмбрионов человека, но его работа оказалась подделкой. Hwang WS, Ryu YJ, Park JH, Park ES, Lee EG, Koo JM, Jeon HY, Lee BC, Kang SK, Kim SJ, Ahn C, Hwang JH, Park KY, Cibelli JB, Moon SY. Evidence of a pluripotent human embryonic stem cell line derived from a cloned blastocyst. Science. 2004 Mar; 303: 1669 -74 Hwang WS, Roh SI, Lee BC, Kang SK, Kwon DK, Kim SJ, Park SW, Kwon HS, Lee CK, Lee JB, Kim JM, Ahn C, Paek SH, Chang SS, Koo JJ, Yoon HS, Hwang JH, Hwang YY, Park YS, Oh SK, Kim HS, Park JH, Moon SY, Schatten G. Patientspecific embryonic stem cells derived from human SCNT blastocysts. Science. 2005 Jun 17; 308: 1777 -83.
Imprinted genes and their role in human fetal growth Abu-Amero S. · Monk D. · Apostolidou S. · Stanier P. · Moore G. Cytogenet Genome Res 113: 262– 270 (2006) (DOI: 10. 1159/000090841) Abstract Growth is defined as the progressive increase in size and is listed as one of the eight main characteristics of life. In human gestation the most rapid growth phase is from 16 to 32 weeks when first there is both cell number and size increase and then from 32 weeks onwards there is continued size increase (Pollack and Divon, 1992). The mechanism of growth in utero is of fundamental interest to clinicians and scientists because of its implications for neonatal health. Growth is multifactorial in origin with both genetics and environment contributing equally large parts. Despite this complexity analysis of the candidate genes involved is possible using simple tissue biopsies at the relevant stages of development. Of particular interest in understanding fetal growth is the analysis of a group of genes that show a parent-of-origin effect known as genomic imprinting. Imprinted genes are not only found in eutherian (placental) and metatherian (marsupial) mammals but surprisingly also in plants. Nevertheless, their evolution in mammals appears to be linked primarily to placentation. It is thought to result from a potential conflict between the parents in terms of the drive to successfully propagate their own separate genes and the mother’s added drive for her survival through the pregnancy to reproduce again. This means that the mother wants to restrict fetal growth and the father to enhance it.
Установление различий в паттерне метилирования в мужских и женских половых клетках: Самцы 1) 2) 3) Самки 1) 2) 3) Roughly equal numbers of imprinted genes are subject to repression from alleles of maternal and of paternal origin. This masks the strong sexual dimorphism that underlies major aspects of imprinted gene regulation. First, imprints are established very early in the male germ line and persist for the reproductive life of the organism, while maternal genomic imprints are established shortly prior to ovulation and are erased soon thereafter in the primordial germ cells of the next generation. Second, many Cp. G island-associated promoters are subject to maternal methylation but no known promoters are subject to paternal-specific germline methylation. The few known paternal methylation marks are kilobases distant from the affected genes and have a low Cp. G density. Third, Dnmt 3 L is required for imprint establishment but not transposon methylation in female germ cells, while Dnmt 3 L is required for transposon methylation and has only a minor role in de novo methylation at imprinted loci in male germ cells. Fourth, maternally expressed genes are commonly repressed on the paternal allele by paternally expressed imprinted genes produced in cis and encoding nontranslated RNAs. It is here suggested that rapid loss of highly mutable methylated Cp. G sites has led to the depletion of methylation target sites in paternally repressed imprinted genes, and that an imprinting mechanism based on RNAs or local inhibitory influences of ongoing transcription of regulatory loci has evolved to counter the erosion of paternally methylated regulatory regions. This mutability model is based on the fact that paternally methylated sequences are maintained in the methylated state for a much longer time than are maternally methylated sequences, and are therefore lost at a correspondingly faster rate. The difference in timing of imprint establishment is likely to underlie the increasing sexual dimorphism of other aspects of imprinted gene expression. Cytogenet Genome Res. 2006; 113(1 -4): 36 -40. Origins of extreme sexual dimorphism in genomic imprinting. Bourc'his D, Bestor TH.
Скачать презентацию Эпигеномная регуляция процессов эбрионального развития млекопитающих Случайная
тема--эпигенетическая регуляция развития млекопитающих.ppt