Эпигенетическая революция А В Рубанович Институт общей генетики

Эпигенетическая революция? А. В. Рубанович Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН rubanovich@vigg. ru

Nessa Carey (2012) The Epigenetics Revolution: How Modern Biology is Rewriting Our Understanding of Genetics, Disease and Inheritance. London: Icon Books Ltd. http: //www. nessacarey. co. uk/epigenetics---the-basics. php

Почему так пафосно? Про эпигенетику мы все давно наслышаны и знаем, что без нее не обойтись Механизмы эпигенетического наследования Метилирование ДНК Модификации гистонов Микро РНК

Тогда почему революция? Далеко не все осознают масштабы кризиса, в котором оказалась современная генетика Кризис имеет имя: Missing Heritability Термин придумал Brendan Maher (ноябрь 2008)

Суть и масштабы проблемы Ведь мы просмотрели все (или почти все? ) В начале века мы научились генотипировать одновременно сильно изменчивые сайты в генах по всем наиболее изменчивым генам (GWAS или широкогеномное сканирование) Оказалось: GWAS (2002) - Genome. Wide Association Studies Мы отличаемся друг от друга примерно каждым тысячным нуклеотидом (1 -2 SNP на 1000 п. н. ), 99. 9% нуклеотидов но эффекты этих различий слишком малы, чтобы объяснить у нас одинаковы! изменчивость и наследуемость большинства признаков 1, 1 vs. 15 ! Что значит «слишком малы» : Где остальная наследуемость? Если (не дай Бог!) у Ваших родителей диабет I типа, то для Вас вероятность заболеть диабетом в 15 раз выше, чем для всех прочих. Т. е. признак наследуется, и должны быть генетические различия между здоровыми и диабетиками. GWAS находит эти различия - аллельные варианты для ~ 20 -40 SNP , p < 10 -8, но эффект мизерный! но при этом среди носителей «рисковых» генотипов доля больных диабетом лишь в 1, 1 раз больше

Методы оценки наследуемости Наследуемость определяется как доля той изменчивости, которая обусловлена генетически : q Сопоставляя фенотипы родственников Степень родства Корреляция фенотипов Родительское среднее – потомки, монозиготные близнецы Родители – потомки, сибсы Дедушки – внуки, Полусибсы h 2/2 …. h 2/4 Самое удивительное, что это работает! h 2 = r. MZ = 2 r. DZ Для 86 признаков r. MZ отличается в среднем от 2 r. DZ не более, чем на 0, 5% (Hill et. al, Plo. S Gen. , 2008) q Вычисляя множественную корреляцию «генотип - фенотип» (должно быть!) Missing heritability:

Доля Суть и масштабы проблемы (по Рeter Visccher, AJHG 2011) Наследуемость по Число топовых объясненной родословным SNP из GWAS наследуемости Фенотип h 2, % #SNP R 2 / h 2 Диабет 1 типа 90 41 0. 3 Диабет 2 типа 30 -60 18 0. 06 Рак груди 30 300 0. 27 Болезнь Крона 60 -80 32 0. 14 Анкилозный спондилит Инфаркт миокарда с зубцом Q > 90 8 0. 22 37 -60 25 0. 14 Шизофрения 70 -80 17 0. 013 Биполярное расстройство (МДС) 60 -70 42 0. 02 Рассеянный склероз Минеральная плотность костей 30 -80 33 0. 02 60 -80 30 0. 07 Рост 80 40 0. 05 Индекс массы тела (BMI) 40 -60 35 0. 03 Missing heritability: , особенно для нейропсихические заболеваний и количественных признаков

Возможные объяснения парадокса «missing heritability» (по Peter Visccher, 2011) В порядке роста правдоподобия и не исключая друга q Неаддитивность действия генов (эпистаз) q Взаимодействия генотип – среда (Gx. E) q Эпигенетические эффекты В 2011 лишь на 3 -ем месте! q Низкая мощность обнаружения малых эффектов «общих полиморфизмов» q Мутации, не относящиеся к SNP (напр. , CNV, STR) q Редкие мутации с большим эффектом

Присмотримся к типичным SNP C Частоты нуклеотидов в ДНК человека: 0. 2 G T A 0. 2 0. 3 Наиболее частый однонуклеотидный полиморфизм: C > T (67%) …GATCAGGCGATTAC… …GATCAGGTGATTAC… …GATCAGGCGATTAC… Наиболее распространенный контекст: CG > TG …GATCAGGCGATTAC… …GATCAGGTGATTAC… …GATCAGGCGATTAC…

Буква С – слабое место в алфавите O NH 2 N O N H O Урацил Цитозин NH 2 N N H Системы репарации исправляют большинство таких замен NH деаминирование Цитозин метилирование O H 3 C O N N H H 3 C NH деаминирование O 5 -метилцитозин Метилирование у млекопитающих преимущественно в динуклеотидах CG 5 -я буква алфавита! N H O Тимин «Законное» основание. Не обнаруживается системами репарации В результате частота мутирования цитозинов в 10 раз выше среднего!

Плохое слово «CG» Частоты букв в геноме C 0. 2 Ожидаемая частота СG = 0. 2 = 0. 04 G 0. 2 Реальная частота CG в 5 раз ниже! T 0. 3 16% всех аминокислотных замен, приводящих к наследственным A 0. 3 болезням, - это замены аргинина J. Shendure et al. Science. 2015. V. 349, 1478– 83 4 кодона из 6 содержат CG Аргинин Аминокислоты

Cр. G-островки и промотеры Динуклеотид CG называют Cp. G-сайтом (~ 30 млн. в геноме человека) 5‘-C-phosphate-G-3' Cp. G сайты распределены в геноме очень неравномерно Cp. G-сайт Обозначения: Метилированный Cp. G-сайт Блок транскрипции Транскрибируемый ген Промотор Экзон 1 Интрон Экзон 2 5` 3` Отдельно стоящие Cp. G-сайты Частота CG < 1% Обычно метилированы (70 -80%) Повторы (Line, Sine, транспозоны) Деметилирование при старении и возрастных заболеваниях Cp. G-островки (5% всех Cp. G, 1% генома) Частота CG > 10% В норме неметилированы Промоторы большинства генов Метилирование при старении и возрастных заболеваниях Старение, рак Транскрипция Нетранскрибируемый ген Промотор Экзон 1 5` Интрон Экзон 2 3`

Метилирование промоторов мешает транскрипционным факторам (TF) Факторы транскрипции – главные «программисты» экспрессии больших групп генов и самое обширное семейство белков у человека (> 2600). Характерная особенность - наличие ДНК-связывающего домена (6 - 16 п. н. ) РНКполимераза Активная транскрипция TF 1 TF 2 Экзон 1 Интрон Экзон 2 5` 3` ДНК-связывающие домены из БД https: //ismara. unibas. ch

Метилирование промоторов мешает транскрипционным факторам (TF) Факторы транскрипции – главные «программисты» экспрессии больших групп генов и самое обширное семейство белков у человека (> 2600). Характерная особенность - наличие ДНК-связывающего домена (6 - 18 п. н. ) РНКполимераза Активная транскрипция TF 1 TF 2 Экзон 1 Интрон Экзон 2 5` 3` Генотоксиканты, радиация, УФ, АФК Старение, рак Активация молчащих генов и транспозонов 5` РНКполимераза Снижение экспрессии защитных генов и генов домашнего хозяйства Репрессия транскрипции TF 1 TF 2 Экзон 1 Интрон Экзон 2 3`

Так для чего все-таки нужно метилирование? Почему регуляция экспрессии реализована через наиболее мутабильные точки генома, коими являются Cp. G-сайты? В сайтах m. Cp. G частота мутаций повышена в 20 -40 раз! Метилирование Краткосрочные эффекты Долгосрочные эффекты Блокировка транскрипции транспозонов и повторов Их дальнейшая инактивация за счет мутирования. То, что давно не считывается, будет покорежено Гены, кодирующие белки, вместе с промоторами

Новейшие достижения эпигенетики Строгая оценка вклада метилирования в наследуемость количественных признаков решает проблему «missing heritability» Cortijo S. , Wardenaar R. , Colomé-Tatché M. et al. Mapping the epigenetic basis of complex traits. Science. 2014 Mar 7 343(6175): 1145 -8. Эпигенетические часы: возрастные изменения паттерна метилирования предсказывают возраст с точностью 3. 6 года Horvath S. DNA methylation age of human tissues and cell types. Genome Biol. 2013; 14(10): R 115. Эпигенетическое старение под действием генотоксических факторов: новый метод оценки эффектов малых доз Доклад Н. С. Кузьминой (ИОГен РАН)

Новейшие достижения эпигенетики Строгая оценка вклада метилирования в наследуемость количественных признаков решает проблему «missing heritability» Cortijo S. , Wardenaar R. , Colomé-Tatché M. et al. Mapping the epigenetic basis of complex traits. Science. 2014 Mar 7 343(6175): 1145 -8. Картирование эпигенетических маркеров сложных признаков Sandra Cortijo Sainsbury Laboratory University of Cambridge Maria Colomé-Tatché Groningen Bioinformatics Centre University of Groningen Netherlands Frank Johannes Technical University of Munich Germany

Дифференциально метилированные инбредные линии ddm 1/ddm 1 F 0 F 1 + / + Ген Ddm 1 (ДНК-метилаза) Cp. G-сайты: Cp. G m. Cp. G Родители генетически изогенны (кроме гена Ddm 1). Полная Все Cp. G-сайты альтернативно эпигетерозигота метилированы Рекомбинантные эпигетерозиготы Отбирали только +/+ F 2 … 500 генетически идентичных линий (epi. RIL) F 8 6 поколений самоопыления Дифференциально метилированные участки перекрывают 82% генома

Свойства линий арабидопсиса epi. RIL – это 500 генетически одинаковых, но дифференциально метилированных инбредных линий арабидопсиса. Все гомозиготно, эпигомозиготно и устойчиво наследуется Локализация метилированных и деметилированных участков для каждой линии epi. RIL была установлена с помощь секвенирования 30% искусственно созданных паттернов метилирования обнаруживаются в природных популяциях Линии epi. RIL существенно отличались по фенотипу, например, по признакам время зацветания (FT) и длина корня (RL).

Эффекты сконструированных эпиаллелей Две повторности: Время зацветания (FT) теплица (1) и поле (2) Длина корня (RL) Локализация метилированных участков log OR Три пика, всего лишь три!!! 3 эпилокуса совместно Наследуемость в скрещиваниях Изменчивость и наследуемость сложного признака FT в основном определяется эпиаллелями 3 локусов Успешное объяснение 87% наследуемости! Наследуемость признака FT, %

Не удивительно, что публикация Сандры Cortijo et al. произвела огромное впечатление Отклики и цитирования (>50) в течении первых 3 месяцев Linda Koch, Nature Reviews Genetics, 2014 и оптимистичные выводы: 7 MARCH 2014 VOL 343 SCIENCE www. sciencemag. org q Эпилокусы гораздо сильнее (на 1 -2 порядка) связаны с фенотипом, чем снипы и другие общие вариации последовательности нуклеотидов (речь не идет о редких мутациях, которые могут иметь значительную пенетрантность). q Число эпилокусов, эффективно влияющих на фенотип, может быть невелико (в отличии от снипов) q У человека эпиаллели могут оказаться эффективными биомаркерами предрасположенности к широко распространенным заболеваниям

Метилирование у человека Уровень метилирования промоторов часто является эффективным биомаркером, D. Fradin et al. PLo. S ONE, 2012, 2 но его наследуемость сильно зависит от популяции и эффектов Gx. E Fraser et al. Genome Biology, 2012, 13

Близнецовые исследования наследуемости метилирования van Dongen J. et al. Genetic and environmental influences interact with age and sex in shaping the human methylome. Nat Commun. 2016 Apr 7; 7: 11115 769 MZ и 424 DZ пар близнецов Уровни метилирования 411 169 аутосомных Cp. G-сайтов Распределение Cp. G-сайтов по уровню метилирования h 2 < 0. 2 Два типа Cp. G-сайтов: Наследуемость q Наследуемое метилирование (h 2 > 0. 5) невысока, но все по - произвольный уровень метилирования теории: h 2 = r. MZ = 2 r. DZ - высокая межиндивидуальная изменчивость - энхансеры, внутригенные Cp. G - неполное деметилирование в гаметах (? ) - ассоциированы с фенотипом q Ненаследуемое метилирование (h 2 <0. 2) - либо гипер- либо гипо- метилирование - низкая межиндивидуальная изменчивость - промоторы блокированных и работающих генов - полное деметилирование в гаметах - ассоциированы с возрастом и возрастными заболеваниями h 2 > 0. 5

Новейшие достижения эпигенетики Строгая оценка вклада метилирования в наследуемость количественных признаков решает проблему «missing heritability» Cortijo S, Wardenaar R. et al. Mapping the epigenetic basis of complex traits. Science. 2014 Mar 7; 343(6175): 1145 -8. Эпигенетические часы: возрастные изменения паттерна метилирования предсказывают возраст с точностью 3. 6 года Horvath S. DNA methylation age of human tissues and cell types. Genome Biol. 2013; 14(10): R 115. Эпигенетическое старение под действием генотоксических факторов: новый метод оценки эффектов малых доз Доклад Н. С. Кузьминой (ИОГен РАН)

Новейшие достижения эпигенетики Стив Ховарт Professor of Human Genetics and Biostatistics University of California, Los Angeles Эпигенетические часы: возрастные изменения паттерна метилирования предсказывают возраст с точностью 3. 6 года Horvath S. DNA methylation age of human tissues and cell types. Genome Biol. 2013; 14(10): R 115. «Просто» регрессия: Age = a + b 1 X 1 + … + b 353 X 353 Предикторы Xi : 353 Cp. G-сайта, отобранные из 21369 Cp. G Данные: 39 обучающих и 32 тестовые выборки (51 вид тканей) !!! Результат в тестовых выборках: Вообще-то такого в биологии не бывает!

Все разом заговорили об эпигенетических часах Цитирования - 432 раза (26. 10. 2016) Воспроизведения и подражания - 144 статьи

Идеальная реализация множественного регрессионного анализа q 7844 человек, 51 тип тканей, 71 выборка 39 обучающих выборок (только здоровые) All Train: r=0. 97, p<10 -200 32 тестовые выборки All Test: r=0. 96, p<10 -200 Ошибка прогноза 3. 6 года q Автоматический отбор 353 Cp. G в обучающих выборках с помощью пенализированной регрессии (elastic net) q Важно: тестовые выборки не использовались для коррекции отбора эффективных предикторов в обучающей выборке q Калибровка зависимой переменной: F(Age) = a + b 1 X 1 + … + b 353 X 353 Эпигенетическая оценка биологического возраста: m_Age = F-1(a + b 1 X 1 + … + b 353 X 353) F 4 линейная log 0 -4 0 40 80 Возраст

Какие Cp. G-сайты вошли в m_age? Комментаторы пишут, что в основном отобранные Cp. G-сайты связаны с генами гибели Все что угодно, и и пролиферации клеток, генами липидного ничего конкретного обмена, иммунной системы, переноса молекул и онкотрансформации клеток Межтканевая дисперсия метилирования … … … 193 положительных (гиперметилируются при старении), конститутивные, в Cp. G-островках промоторов генов + 160 отрицательных Для положительных сайтов (гипометилируются при старении), межтканевая изменчивость уровня метилирования тканеспецифичные понижена и/или индуцируемые, вне Cp. G-островков промоторов генов

r = 0. 95, p = 10 -11 Aging clock applied to urine! Свойства показателя m_age Применим ко всем тканям Может оценивать эпигенетический возраст различных органов. Например, ткани женских молочных желез всегда «старше» других тканей в среднем на 2 -3 года Близок к нулю для эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток Работает на приматах (шимпанзе, бонобо) r =1. 00, p = 10 -200 Невероятная воспроизводимость: из почты Стива Ховарта (янв. 2014)

Модификации часов Ховарта q 73 Cp. G-часы, Hannum et al. Mol Cell (2013), 49 r = 0. 96, ошибка 3. 6 лет в тестовой выборке, регрессия зависит от вида ткани Платформа: Illumina chip q 3 Cp. G-часы, Weidner et al. Genome Biology (2014), 15: R 24 r = 0. 81, ошибка 5. 6 лет в тестовой выборке, только на образцах крови Платформа: бисульфатное пиросеквенирование X 1 - cg 02228185 (ASPA) Predicted age = 38. 0 - 26. 4 X 1 - 23. 7 X 2 + 164. 7 X 3 , X 2 - cg 25809905 (ITGA 2 B) X 3 - cg 17861230 (PDE 4 C) q Часы «Cp. G + теломера» , Marioni et al. Int J Epid (2016) 1– 9 Корреляция возраста с длиной теломер: r = - 0. 3 При этом Cp. G и теломеры – независимые предикторы Теломеры не улучшают Cp. G-часы Cp. G + теломеры: большие надежды были и остаются! R 2 Тм Cp. G+Тм

Преждевременное старение и риск смерти Age acceleration: age = m_Age – Age Для квартилей: Q 1( age) q age коррелирует со смертностью по совокупности причин: если Δage > 5 лет, то смертность возрастает на 21%. Для 5%-квантиля Δage риск скорой смерти увеличивается 50% Q 4( age) q У мужчин age всегда больше, чем у женщин q Величина age наследуется в поколениях: h 2 = 0. 43 для взрослых и h 2 = 1 для новорожденных (близнецовый анализ) Люди старше 75 лет q Ускоренное старение при заболеваниях и внешних воздействиях: - для тканей 20 видов раковых опухолей в среднем age= 36 лет (Horvath, 2013) - при ВИЧ-инфекции age= 7. 4 лет, р = 10 -7 (Horvath, 2015) - при синдроме Дауна age= 6. 6 лет, р = 10 -13 (Horvath, 2016) - при ранней менопаузе, р = 10 -3 (Horvath, 2016) - уровень детского стресса коррелирует с age: r = 0. 18, p=0. 02 (Zannas, 2015) - значимая сопряженность с диабетом, гипертензией, ЛПВП (Horvath, 2016) - при воздействии генотоксикантов? (Kuzmina, 2016)

Новейшие достижения эпигенетики Строгая оценка вклада метилирования в наследуемость количественных признаков решает проблему «missing heritability» Cortijo S. , Wardenaar R. , Colomé-Tatché M. et al. Mapping the epigenetic basis of complex traits. Science. 2014 Mar 7 343(6175): 1145 -8. Эпигенетические часы: возрастные изменения паттерна метилирования предсказывают возраст с точностью 3. 6 года Horvath S. DNA methylation age of human tissues and cell types. Genome Biol. 2013; 14(10): R 115. Эпигенетическое старение под действием генотоксических факторов: новый метод оценки эффектов малых доз Доклад Н. С. Кузьминой (ИОГен РАН)

Новейшие достижения эпигенетики Что могут дать эпигенетические исследования радиобиологии: - маркеры отдаленного радиационного воздействия (гиперметилирование промоторов нескольких генов) - индивидуальные оценки совокупного ущерба от облучения в терминах преждевременного старения (Cp. G-часы по промоторам не менее 100 генов) Мы толком не знаем, в чем риск повышенного уровня хромосомных аберраций (комет, -фокусов, TCR-мутаций и пр. ), но хорошо понимаем, что означают лишние 7 лет. Эпигенетическое старение под действием генотоксических факторов: новый метод оценки эффектов малых доз Доклад Н. С. Кузьминой (ИОГен РАН)

Спасибо организаторам Конференции, городу Дубне и всем присутствующим! Слайды доступны! Другие мои лекции можно найти на сайте vigg. ru rubanovich@vigg. ru