ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ Характеристики световой микроскопии: n n

ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ

Характеристики световой микроскопии: n n Разрешающая способность — ограничена дифракцией света — до 0. 2 мкм Полезное увеличение — 500 - 1000 Глубина резкого изображения — ориентировочно 0. 5 мкм Работает при атмосферном давлении!

прибор, который позволяет Сканирующая получать увеличенное (растровая) электронная изображение объектов, микроскопия используя для их освещения электроны Scanning electron microscopy (SEM) Просвечивающая электронная микроскопия Transmittance electron microscopy (TEM)

Варианты электронной микроскопии n Просвечивающая Электроны n Сканирующая Образец Детектор Электроны Детектор Образец

Электронная микроскопия 1930 n n n 1873 год: разрешение микроскопов ограничено длиной волны света » вместо световых лучей предложено использовать катодные 1897 год: Томсон обнаружил, что катодные лучи являются потоком электронов 1924 год: Де Бройль установил двойственную природу элементарных частиц и показал, что λ = h / mv

n n n n В 1931 Р. Руденберг - патентная заявка на просвечивающий электронный микроскоп, в 1932 М. Кнолль и Эрнст Руска построили первый микроскоп. В 1938 Руска и Б. фон Боррис построили прототип промышленного ПЭМ для фирмы «Сименс-Хальске» в Германии; (разрешение 100 нм). А. Пребус и Дж. Хиллер построили первый ПЭМ высокого разрешения в Торонтском университете (Канада). РЭМ в его нынешней форме был изобретен в 1952 Чарльзом Отли. В 1960 -х годах разрабатывались сверхвысоковольтные микроскопы для исследования более толстых образцов. В 1970 был введен в действие прибор с ускоряющим напряжением, равным 3, 5 млн. вольт. РТМ был изобретен Гердом Биннигом и Генрихом Рорером в 1979 в Цюрихе. За свою работу по созданию РТМ Бинниг и Рорер (одновременно с Руской) получили Нобелевскую премию по физике

Какова длина волны электрона в электронной микроскопии? n В микроскопах электроны можно ускорить потенциалом U до 100 000 В n n Работа сил электрического поля U∙e расходуется на сообщение электронам кинетической энергии Комбинируя эту формулу и уравнение де Бройля, получаем:

n При ускоряющем напряжении 10 000 В получим: Длина волны УФ света – 3 10 -7 м

ПРОСВЕЧИВАЮЩИЙ ЭЛЕКТРОННЫЙ МИКРОСКОП SEO TEM 100 k. V

Разрешающая способность: гарантированная достижимая Ускоряющее напряжение 25 -100 к. В (шаг 25 к. В), Диапазон увеличений(электрон ных) 100 крат-400 000 крат, Источник электронов V-образный вольфрамовый катод, ток пучка 100 мк. А для 100 к. В 0, 5 0, 34 нм нм

Аденовирус Вирус герпеса

Просвечивающий электронный микроскоп 1. Катод 2. Управляющий электрод 3. Анод 4. Конденсорная линза 5. Объективная линза 6. Апертурная диафрагма 7. Селекторная диафрагма 8. Промежуточная линза 9. Проекционная линза 10. Экран

Подготовка образцов для анализа ПЭМ n n Объект должен быть тонким, но при этом должен поглощать или рассеивать электроны Подготовка биологических объектов чрезвычайно сложна; в вакууме происходит обезвоживание и разрушение образца под электронным пучком

Пробоподготовка n n n 1. Объект помещают в фиксирующее вещество (эпоксидная смола) 2. Делают срезы при помощи микротома толщиной до 5 нм 3. Срезы помещают на сетку При необходимости проводят «окрашивание» тяжелыми атомами При исследовании вирусов и т. д. их помещают в специальную жидкость, каплю наносят на подложку; после высушивания рассматривают в микроскоп

В итоге n n n 1. ПЭМ позволяет рассматривать тонкие прозрачные слои с разрешением до 0, 5 нм, полезное увеличение — до 1000000 2. Контраст обеспечивается упругим рассеянием электронов на ядрах (поглощение и дифракция) 3. Анализ разрушающий

Растровый электронный микроскоп Микро. Скан МС-20

Сканирующий электронный микроскоп n n В варианте «на отражение» рассматривают массивные объекты Существует несколько механизмов формирования контраста Разрешение немного хуже, чем в просвечивающем варианте Необходима высокая тепло- и электропроводность объектов !

Формирование контраста Падающие электроны Отраженные электроны Вторичные электроны (до 50 э. В) Катодолюминесценция Рентгеновские лучи Прошедшие электроны

Сканирующий (растровый) электронный микроскоп 1. Катод 2. Управляющий электрод 3. Анод 4, 5. Кинескопы 6, 7. Конденсорные линзы 8. Объективная линза 9. Растровые катушки 10. Детектор(ы) 11. Усилитель 12. Система синхронного сканирования

Разрешающая способность в режиме ВЭ 5 -10 нм Рабочий отрезок 5 - 40 мм Диапазон ускоряющих напряжений 0. 1 – 30 к. В Диапазон увеличений 10 – 300 000 крат Диапазон тока пучка 1 п. А – 1 мк. А Перемещение объекта по осям x, y, X= ± 40 мм, Y= ± 40 мм, Т= – 5 до мм +60°, R=360°, Z= 8 до 35 мм Рабочий вакуум в камере обьектов: высоковакуумный режим низковакуумный режим 1 х 10 -5 Торр 1 -20 Торр Время получения рабочего вакуума 20 мин Готовность прибора к работе после 5 мин смены объекта Потребляемая мощность 220 В(+- 10%), 50/60 Гц, 2 к. ВА Водяное охлаждение 2 л/мин, давление: от 0. 05 до 0. 2 Мпа, температура: 20°± 5° С Размеры главной консоли прибора 650 х 850 мм (длина, ширина, высота)

Анализ биологических объектов n n n 1. Для предотвращения обезвоживания объект либо помещают в фиксирующее вещество, либо замораживают при температуре жидкого азота 2. Для создания электропроводности на объект напыляют углеродную или металлическую пленку 3. В последнее время разработаны микроскопы, работающие при относительно низком вакууме (20 Па), но разрешение таких приборов хуже

Электронный микроскоп низкого давления JEOL

В итоге n n 1. СЭМ (РЭМ) позволяет получить изображения массивных объектов с большой глубиной резкости и разрешением до 5 нм, 2. Работает в вакууме! Анализ влагосодержащих объектов затруднен 3. При облучении электронами возможно разрушение образцов вследствие теплового и радиационного воздействия. Требуются тепло - и электропроводящие образцы, устойчивые в вакууме 4. Существует много аналитических сигналов

Сканирующая зондовая микроскопия

Сканирующая зондовая микроскопия Сканирующая ближнепольная оптическая микроскопия Сканирующая туннельная микрокопия (STM) Атомно-силовая микроскопия (atomic force microscopy, AFM)

Сканирующий туннельный микроскоп, 1982, Г. Бинниг, Г. Рорер

Принцип действия n n 1. На электромеханическом приводе смонтировано тонкое металлическое острие, которое находится на расстоянии туннельного вакуумного промежутка (0, 3 – 1 нм); 2. приложении небольшого напряжения (0, 01 – 10 В) протекает туннельный ток (1 – 10 н. А)

Аналитический сигнал n n 1. Туннельный ток при постоянном расстоянии от острия до поверхности образца; 2. Расстояние при постоянном туннельном токе.

Сложности в конструировании и изготовлении СТМ n n 1. Изоляция от вибраций; 2. быстродействующая малошумящая электроника; 3. надежный сверхвакуум (хотя прибор может работать в газе и в жидкости); 4. тонкие атомногладкие острия-зонды.

Особенности применения n n Требуются проводящие образцы, физика поверхности твердых тел Исследование диэлектриков на подложке (белки)

Атомно-силовая микроскопия – разновидность СЗМ (1986)

Детектор света лазер кантилевер образец

Принцип действия n n n На кантилевере закреплен зонд (диаметр наконечника 10 – 20 нм). Зонд сканирует поверхность образца, регистрируя слабые взаимодействия (п. Н – н. Н). Лазерный луч детектирует изгибы кантилевера.

Преимущества n n n 1. не требуется проводящих образцов, 2. такое же ангстремное разрешение. Исключительно полезный инструмент анализе биологических систем (прямое наблюдение ДНК)

Сканирующая ближнепольная оптическая микроскопия n n n Преодоление дифракционного предела! Сочетание сканирующей зондовой микроскопии и обычной оптики Главная часть микроскопа – оптический зонд диаметром меньшим, чем длина волны Зонд сканирует поверхность образца Отраженные и рассеянные фотоны улавливаются объективами и попадают на ФЭУ

Сканирующая ближнепольная оптическая микроскопия

Условие ближнего поля (дифракции Френеля)

Преимущества n n Расчетное разрешение 13 нм (до 1 нм в безапертурных приборах) Применение в наноэлектронике СБОМ регистрирует отдельные молекулы флуорофоров, в т. ч. при наносекурндом разрешении Большой интерес для биологии (van Hulst показал обнаружения люминесцентных меток сцепленных с участками ДНК или внутриклеточными структурами)