Электрофорез в полиакриламидном геле Электрофорез в полиакриламидном

Электрофорез в полиакриламидном геле

Электрофорез в полиакриламидном геле (сокр. электрофорез в ПААГ, ПААГ электрофорез; англ. PAGE, Polyacrylamide Gel Electrophoresis) — метод молекулярной биологии и биохимии, используемый для разделения белков и нуклеиновых кислот, основанный на движении заряженных биологических макромолекул в постоянном электрическом поле. Разделение в полиакриламидном геле происходит за счёт различий заряда разделяемых молекул и отличий молекулярных масс, а также от конфигурации молекул. Разделяют неденатурирующий, или нативный ПААГ-электрофорез (при котором разделяемые биологические макромолекулы в процессе электрофореза остаются в нативном состоянии) и денатурирующий ПААГ-электрофорез (при котором пробы предварительно денатурируют, в случае нуклеиновых кислот используют непродолжительное нагревание пробы с формамидом либо глиоксалем, для денатурации белков обычно используют кипячение пробы в буфере, содержащем сильный ионный детергент (обычно додецилсульфат натрия) и агент, разрушающий четвертичную структуру белка за счёт разрушениядисульфидных мостиков между глобулами белка и внутри полипептидной цепи — бетамеркаптоэтанолом).

Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях — метод фракционирования белков по различиям молекулярной массы. Скорость миграции белка в электрическом поле зависит не только от его суммарного . заряда, но также и от величины и формы белковой молекулы Для электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях в анализируемую смесь белков добавляют додецилсульфат натрия, который представляет собой детергент с выраженными амфифильными свойствами. При этом олиго-мерные белки распадаются на протомеры, протомеры денатурируются и денатурированные пептидные цепи образуют мицеллы с ДДС-Na, содержащие примерно вдвое больше белка, чем ДДС-Na. Эти мицеллы имеют отрицательный заряд, обусловленный почти полностью ионами ДДС (C 12 H 25 OSO~3). Суммарный заряд мицеллы пропорционален содержанию в ней ДДС-Na, а содержание ДДС-Na пропорционально размеру пептидной цепи. Таким образом, в этом случае белки (точнее — пептидные цепи) разделяются не по их заряду (поскольку заряд мицелл определяется почти полностью ДДС-Na), а по молекулярной массе пептидных цепей.

Электрофорез белков Метод основан на том, что при определённом значении р. Н и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки - к катоду (-). В полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам. Разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле выше, чем на бумаге. Так, при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге обнаруживают только 5 главных фракций: альбумины, α 1 глобулины, α 2 -глобулины, β-глобулины. Электрофорез тех же белков в полиакриламидном геле позволяет получить до 18 различных фракций. Для обнаружения белковых фракций полоски бумаги или столбики геля обрабатывают красителем (чаще всего бромфеноловым синим или амидовым чёрным). Окрашенный комплекс белков с красителем выявляет расположение различных фракций на носителе.

Метод горизонтального электрофореза Для визуализации результатов амплификации используют различные методы. Наиболее распространенным на сегодняшний день является метод электрофореза, основанный на разделении молекул ДНК по размеру. Для этого готовят пластину агарозного геля, представляющего собой застывшую после расплавления в электрофорезном буфере агарозу в концентрации 1, 5 -2, 5% с добавлением специального красителя ДНК, например, бромистого этидия. Застывшая агароза образует пространственную решетку. При заливке с помощью гребенок в геле формируют специальные лунки, в которые в дальнейшем вносят продукты амплификации. Пластину геля помещают в аппарат для горизонтального гельэлектрофореза и подключают источник постоянного напряжения. Отрицательно заряженная ДНК начинает двигаться в геле от минуса к плюсу. При этом более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. На скорость движения ДНК в геле влияет концентрация агарозы, напряженность электрического поля, температура, состав электрофорезного буфера и, в меньшей степени, ГЦ-состав ДНК. Все молекулы одного размера движутся с одинаковой скоростью. Краситель встраивается ( интеркалирует) плоскостными группами в молекулы ДНК. После окончания электрофореза, продолжающегося от 10 мин до 1 часа, гель помещают на фильтр трансиллюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне (254 - 310 нм). Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260 нм, передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра (590 нм).

Метод вертикального электрофореза принципиально схож с горизонтальным электрофорезом. Их отличие заключается в том, что в данном случае вместо агарозы используют полиакриламидные гели. Его проводят в специальной камере для вертикального электрофореза. Электрофорез в полиакриламидном геле имеет большую разрешающую способность по сравнению с агарозным электрофорезом и позволяет различать молекулы ДНК разных размеров с точностью до одного нуклеотида. Приготовление полиакриламидного геля несколько сложнее агарозного. Кроме того акриламид является токсичным веществом. Поскольку необходимость определить размер продукта амплификации с точностью до 1 нуклеотида возникает редко, то в обычной работе используют метод горизонтального электрофореза.

Особенности электрофореза в полиакриламидном геле Полиакриламидный гель (ПААГ) обладает многими качествами идеального носителя. Имея свойства молекулярного сита, он обеспечивает электрофоретическое разделение белковых смесей не только по заряду, но и по размеру и форме частиц. При электрофорезе в ПААГ крупные молекулы, размеры которых соизмеримы с диаметром пор геля, движутся медленнее, а мелкие молекулы свободно и быстро проходят через поры геля. ПААГ формируют путем сополимеризации акриламида (создающего линейную “основу”) и N, N′-метиленбисакриламида (служащего для поперечных “сшивок” линейных цепей). СН 2 = СН-СО-NН 2 СН 2 = СН-СО-NН-СН 2 -NН-СО-СН = СН 2 Акриламид N, N′ -метиленбисакриламид. Меняя концентрацию акриламида от 2 до 50% можно задать определенную пористость геля. Например, диаметр пор в геле, содержащем 7, 5% акриламида, равен 5 нм, а 30% акриламида - 2 нм. При выборе концентрации геля учитывают среднюю молекулярную массу ( Mr) разделяемых веществ и форму их молекул.

Проведение электрофореза Наиболее часто разделение осуществляется на пластинах, покрытых слоем геля толщиной 2 -3 мм. Размеры пластины 10 х 14 см или иное, в зависимости от конструкции прибора. В процессе электрофореза пластина с гелем разогревается в результате протекания через нее тока. Степень разогрева пластины зависит от величины напряжения, при котором происходит разделение. Чем выше напряжение, тем выше сила протекающего по пластине тока и сильнее ее разогревание, поэтому применение высоких напряжений должно сопровождаться охлаждением пластины, чтобы не допускать тепловую денатурацию разделяемых белков. Величина продвижения белков в геле зависит (в идеале) только от величины наложенного потенциала и времени. При потенциале 500 В разделение может закончиться за 4 часа, а при потенциале 150 В на это потребуется около 14 часов.

Анализ результатов