Электрофорез перемещение заряженных молекул под действием электрического

Электрофорез – перемещение заряженных молекул под действием электрического поля к катоду или аноду в зависимости от знака их суммарного заряда.

Скорость движения идеализированной сферической частицы в электрическом поле z - заряд частицы E - напряженность электрического поля - вязкость среды r - радиус частицы Скорость движения частиц (см/мин) при напряженности электрического поля 1 В/см называется электрофоретической подвижностью. Она имеет размерность см 2·мин-1·В-1, а ее знак совпадает со знаком суммарного заряда. Различия в подвижности частиц служит основой для разделения смесей методом электрофореза.

Классификация электрофоретических методов разделения По характеру движения зоны Øэлектрофорез с подвижной границей Øзональный электрофорез Øстационарный или вытесняющий ЭФ (изотахофорез, изоэлектрофокусирование) По типу поддерживающей среды ØЭФ в свободной среде ØЭФ в градиенте плотности ØЭФ в поддерживающих средах с капиллярной структурой • электрофорез на бумаге, • электрофорез на ацетата целлюлозы, • гель-электрофорез (в ПААГ, в агарозном и агаровом геле, в крахмальном геле, в гранулированных гелях)

Классификация электрофоретических методов разделения По форме и расположению поддерживающей среды Øгоризонтальный ЭФ (в прямоугольных блоках (пластинах), в тонком слое жидкости, во вращающихся трубках) Øветикальный (в прямоугольных блоках, в трубках) Øкапиллярный электрофорез. По количеству направлений миграции Øодномерный Øдвумерный

Электрофорез с подвижной границей

Электрофорез с подвижной границей

Проточный электрофорез в тонком слое жидкости

(A) Трубки (B) Вертикальные пластины (C) Горизонтальный погружной (D) Горизонтальный тонкий слой с буферными прокладками

Погружной электрофорез (Submarine Cell)

Горизонтальный электрофорез Загрузка образцов в «колодцы» . Три различных метода А Нанесение образцов на гель с использованием кусочков фильтровальной бумаги (А) и с использованием аппликатора (Б) Б

Вертикальный электрофорез

Вертикальный электрофорез Формирование карманов и загрузка образцов

Капиллярный электрофорез

Капиллярный электрофорез

Электрофорез в агарозном геле Формирование агарозного геля. А – заливка горячего раствора агарозы в форму. Б – установка «гребенки»

Полиакриламидный гель CH 2=CH-CONH 2 Акриламид CH 2=CH-CO OC-CH=CH 2 | | NH-CH 2 -NH N, N’-метиленбисакриламид (5 -15%) (2 -4%) (CH 3)2 N-CH 2 -N(CH 3)2 ТЕМЕД (NH 4)2 S 2 O 8 Персульфат аммония

Агарозный и полиакриламидный гели (A) Agarose gels form by noncovalent hydrogen and hydrophobic bonds between long sugar polymers. (B) Acrylamide gels have covalent cross-links ( • ) between polymer strands.

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ Изменение заряда белка в зависимости от p. H

Изоэлектрическое фокусирование Амфолиты должны отвечать следующим требованиям: Øотсутствие взаимодействия с белками, Øнизкая молекулярная масса, Øнаименьшее возможное различие между р. К и p. I, Øхорошая электропроводность, Øнаименьшее возможное поглощение света в области УФ-поглощения белков, Øравномерное распределение зон p. I амфолитов, Øмаксимальное количество различных значений р. I.

Immobilized p. H gradient polyacrylamide gel matrix showing attached buffering groups

Изотахофорез Электрическая подвижность ионов уменьшается в ряду UA>UB>UC>UD После достижения фазы 3 длина и форма зон больше не меняются Схематическое изображение концентраций ионов в условиях изотахофореза Ионы системы ИТФ

Диск-электрофорез А. Начало электрофореза Б. Белки в концентрирующем геле В. Белки в процессе разделения

Разделение белков по размера с использованием ДС-Na За счет гидрофобных взаимодействий детергент примерно одинаково связывается с подавляющим большинством белков в соотношении примерно 1, 4 мг ДС-Na на мг белка

Электрофорез в градиенте пористости ПААГ

Иммуноэлектрофорез (а) очищенного плазменного альбумина (b) Ig. G. Каждая проба шла вместе с цельной плазмой для сравнения. Перекрестныный ИЭФ-иммуноэлектрофорез плазмы крови человека. Ракетный электрофорез фактора комплемета C 3.

Двумерный электрофорез

Двумерный электрофорез

Обнаружение белков на электрофореграммах

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Поведение разных форм НК в геле Поведение нуклеиновых кислот в геле сильно зависит от их вторичной структуры: 1. Однонитевые и двунитевые молекулы. В поведении однонитевых (РНК, денатурированная ДНК) и двунитевых молекул НК многое определяется их размерами. В случае коротких полинуклеотидных цепей нативная двунитевая молекула имеет более жесткую структуру, чем таких же размеров однонитевая. Она труднее изгибается, проходя через пространственную сетку геля. В силу этого, например, относительно короткие двунитевые фрагменты ДНК при близких к нейтральному значениях р. Н будут отставать при электрофорезе в ПААГ от денатурированных ДНК такой же длины. Однако для более крупных молекул ситуация может измениться на противоположную. Длинная двунитевая цепочка оказывается уже в целом довольно гибкой: она продвигается через поры геля, как бы «извиваясь ужом» . Между тем однонитевая цепь той же длины сворачивается в «хаотический клубок» такого размера, что его продвижение в геле оказывается более затрудненным. В этом случае денатурированная ДНК при электрофорезе отстает от нативной. Естественно, что граница обращения описанного эффекта зависит от размера пор геля.

Поведение разных форм НК в геле 2. Кольцевые ДНК. Двунитевые ДНК форм I, II и III. Вирусные и митохондриальные двунитевые ДНК, а также плазмиды бактерий могут иметь структуру замкнутого двунитевого кольца. Нативное состояние такого кольца - «сверхскрученное» . Кольцо в целом сворачивается в «жгут» , что сильно увеличивает его компактность (форма I). Если же хотя бы в одной из двух нитей кольца имеется единичный разрыв сахарофосфатной цепи, то «жгут» разворачивается и силами электростатического отталкивания фосфатных групп кольцо расправляется. Компактность молекулы становится меньше, наружные размеры увеличиваются (форма II). Форма I при электрофорезе всегда мигрирует быстрее, чем форма II. Что касается линейной двунитевой молекулы ДНК (форма III), то она может мигрировать быстрее или медленнее, чем сверхскрученное кольцо одинаковой с ней молекулярной массы, в зависимости от среднего размера пор геля. Для крупнопористого геля решающим фактором может оказаться компактность формы I, для мелких пор на первый план выступает большая гибкость линейной молекулы.

Скорость миграции линейных двунитевых молекул ДНК уменьшается с увеличением их молекулярной массы, но лишь до определенного предела. При молекулярной массе более 5 млнв 1, 6 %-ном геле агарозы и более 12 млн. в 0, 8 %-ном линейные молекулы ДНК мигрируют с одинаковой скоростью независимо от их молекулярной массы (!) и, следовательно, не могут быть разделены электрофорезом. Это происходит именно вследствие гибкости длинных молекул ДНК. Их противоположные концы мигрируют в электрическом поле независимо друг от друга, и вся молекула, извиваясь, проходит через гель одинаково легко (или одинаково трудно) при любой ее длине.

Электрофорез в пульсирующем электрическом поле (пульсфорез)

Two different fields are applied, using the HEX electrode. The figures show isofield lines. (a) North/South field (b) East/West field. Two different fields are applied using the point electrodes (DI configuration). The figures show isofield lines. (a) North/South field (b) East/West field

Обнаружение НК на электрофореграммах Бромистый этидий Ethidium bromide is a powerful mutagen and moderately toxic. Gloves should be worn when working with solutions that contain this dye.

Лидирующие красители Бромфеноловый синий Ксиленцианол

Маркерные молекулы 1. Рестрицированные природные ДНК 2. DNA laddrs & rullers λ/Pst. I 10 -200 λ/Eco. RI 500 -10000

Источники питания PS 2 A 200 Power supply is a high current power supply ideal for all types of electrophoresis blotting and short electrophoresis runs. • 200 V, 2000 m. A, 200 W maximum. • Constant voltage, constant current, or constant power modes. • 4 timer options to choose from: continuous run, set time run followed by a hold at 5 V, or set Volt-hour run. • Single unit increments in settings and read-outs for precision and reproducibility. • Print log of run parameters via RS 232 port. • Designed for high current applications such as tank blotting. • Stores and recalls three protocols.

Разделение плазмы крови человека и маркерных белков DISCэлектрофорезом в трубках Анализ животной плазмы крови электрофорезом в градиенте пористости полиакриламида 4/30 Разделение белков с SDS по Лэммли Двумерный электрофорез гомогената E. coli. Pharmalyte 3 -10 – SDS PAGE

5– 20% acrylamide gradient gel. 0. 75 mm-thick SDS gel was separated overnight at 4 m. A and stained with Coomassie Blue. Outside lanes contain protein standards with their sizes listed in kilodaltons