Электрофорез Лекция 9 по физической химии для

Электрофорез Лекция № 9 по физической химии для мед. биохимиков и мед. биофизиков Доцент, к. х. н. Сычева И. М.

Цель лекции: Изучение явления электрофореза на примере электрофореза белков плазмы крови и фрагментов ДНК Актуальность темы: Электрофорез находит применение как метод физиотерапии и как способ диагностики белков, липопротеидов и ДНК.

План лекции: • 1. Электрофорез понятие, использование в медицине. • 2. Электрофорез на бумаге. • 3. Электрофорез белков плазмы крови. • 4. Электрофорез ДНК. • 5. Полиморфизм длин рестриктов, блотинг. • 6. Секвенирование генов по Сэнджеру.

Электрофорез — это двихение частиц дисперсной фазы (коллоидных или белковых растворов) в жидкой среде под действием внешнего электрического поля. Впервые было открыто профессорами Московского университета П. И. Страховым и Ф. Ф. Рейссом в 1809 году.

• В биохимии и молекулярной биологии электрофорез используется для разделения макромолекул — белков и нуклеиновых кислот (а также их фрагментов). • Различают множество разновидностей этого метода. Этот метод находит широчайшее применение для разделения смесей биомолекул.

Электрофорез в медицине (физиотерапии) – Лечебное вещество наносится на прокладки электродов и под действием электрического поля проникает в организм через кожные покровы или слизистые оболочки (в стоматологии, ЛОР, гинекологии и др. ) – влияет на физиологические и патологические процессы непосредственно в месте введения. – Электрический ток также оказывает нервнорефлекторное и гуморальное действие.

Преимущества лечебного электрофореза: • введение малых, но достаточно эффективных доз действующего вещества; • возможность создания высокой местной концентрации действующего вещества без насыщения им лимфы, крови и других сред организма; • возможность введения вещества непосредственно в очаги воспаления, блокированные в результате нарушения локальной микроциркуляции; • слабый электрический ток благоприятно влияет на реактивность и иммунобиологический статус тканей.

• Скорость u движущихся частиц приближённо связана с напряжённостью электрического поля Е уравнением Смолуховского: • где h — вязкость среды, D — диэлектрическая проницаемость

• • При помощи электрофореза на бумаге разделяют фракции белков, липопротеидов, гликопротеидов, а также белковые фракции мочи, желудочного сока, экссудатов и т. п. В крови электрофорез выявляет 5 основных фракций белка: альбумины, альфа-1 (α 1) альфа 2(α 2)-, бета(β)- и гамма(γ)-глобулины. В норме их соотношение более или менее постоянно.

Электрофорез на бумаге. Этапы • 1. Готовят буфер (трис, боратный или мединал-вераналовый). • 2. полосы фильтровальной бумаги смачивают раствором свежего буфера. Избыток буфера удаляют, отжимая полосы между лентами фильтровальной бумаги, и помещают их в электрофоретическую камеру. • 3. Камеру заливают буфером.

Прибор для горизонтального электрофореза

• 4. На край ленты наносят по 5— 10 мкл негемолизированной сыворотки в виде поперечной полосы, отступив на 0, 5 см от краев. • 5. Проведение электрофореза: камеру закрывают крышкой и проводят электрофорез сыворотки в течение 6— 24 ч при напряжении от 3 до 8 В на 1 см пути. • 6. Продолжительность электрофореза устанавливают в зависимости от силы и напряжения тока, вида буферного раствора, р. Н, длины, ширины и толщины бумажных полос.

• 7. выключают ток, вынимают ленты, сушат в сушильном шкафу в течение 10 мин при температуре 105 °С • 8. Красят, погружая в раствор красителя на 20 мин. Краситель сливают и ленты несколько раз промывают 20 г/л раствором уксусной кислоты до устранения фона (окрашенные участки бумаги, свободные от белка). • 9. Ленты вновь просушивают на воздухе.

• Элюирование: кусочки ленты, содержащие отдельные фракции, вырезают и помещают в пробирки для элюирования. • Для этого в каждую пробирку с глобулиновой фракцией приливают по 10 мл 0, 02 моль/л раствора Na. OH, к альбуминовой фракции — 20 мл и оставляют в течение 1— 2 ч. • Измерение проводят на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 1 см против 0, 02 моль/л раствора Na. OH при 500— 560 нм (зеленый светофильтр). • Величину экстинкции альбуминов умножают на 2. Определяют сумму экстинкции всех фракций, принимая ее за 100%, и вычисляют долю каждой фракции

• Бумажная лента может быть расположена горизонтально (горизонтальный электрофорез) или под углом (вертикальный электрофорез). При горизонтальном электрофорезе бумажная лента должна быть хорошо натянута.

Приборы для вертикального электрофореза

Основные принципы электрофореза • Большинство глобулярных белков сформированы таким образом, что большая часть заряженных групп, расположена на поверхности белка, тогда как незаряженные, гидрофобные остатки погружены во внутрь глобулы. • В электрическом поле в соответствии со своим зарядом белки мигрируют по направлению к противоположно заряженному электроду.

• Электрофорез белков помогает выявить заболевания печени и почек, иммунной системы, некоторые злокачественные новообразования (лейкозы), острые и хронические инфекции, генетические поломки и др. • Известен ряд своеобразных электрофоретических "синдромов" – типичных картин электрофореграмм, характерных для некоторых патологических состояний.

Электрофореграмма белка плазмы крови

Электрофорез в полиакриламидном геле • В синтетический гелевой среде на основе полиакриламида Подвижность является функцией размера белковой глобулы и суммарного заряда. • В этих условиях белки с различными молекулярными массами могут иметь одинаковую подвижность.

Полиакриламидный гель • Основной характеристикой полиакриламидного геля является размер пор, которые образуются при его полимеризации. Этот показатель определяет способность биомакромолекул продвигаться внутри геля в процессе проведения электрофореза.

Ацетат целлюлозы

• Использование мембран из ацетата целлюлозы позволяет достичь: • однородность материала, • очень малую емкость слоя, требующую микроколичеств пробы (0, 4– 2, 0 мкл), • быстроту разделения и окраски белков (20 -80 мин), • легкость отмывания фона, а также относительно • низкую стоимость пленок и их доступность.

Острое воспаление • Увеличивается синтез острофазных белков (a 1 -антитрипсина, гаптоглобина, фибриногена и др. ). • увеличиваются доли a 1 - и a 2 -глобулинов • можно подтвердрить измерением СОЭ, исследованием концентрации С-реактивного белка, фибриногена (в динамике) и других острофазных белков.

Хроническое воспаление • Из-за усиления синтеза ряда острофазных белков, а также иммуноглобулинов проявляется умеренным возрастание a 2 - и b -глобулинов, • повышением g-глобулинов • снижением альбумина. • Подобные отклонения могут наблюдаться при хронических инфекциях, коллагенозах, аллергии и аутоиммунных процессах

Тяжелые заболевания печени • сопровождаются снижением синтеза альбумина и a‑глобулинов (в г/л). • При хронических гепатитах и циррозах печени возрастает как относительное, так и абсолютное количество g-глобулинов (b- и gфракции могут сливаться из-за накопления Ig. A), • превышение g-глобулинов над альбуминами является весьма неблагоприятным прогностическим признаком.

Нефротический синдром • Сопровождается увеличением фильтрации белков в почках и потерей с мочой большого количества альбумина и части низкомолекулярных глобулинов. • При этом в печени усиливается синтез более крупных протеинов семейства a 2 -глобулинов (макроглобулин, апо-В), которые накапливаются в крови и формируют картину со значительным снижением альбумина и повышением a 2 -глобулинов.

Нарушение всасывания или значительная потеря белков • • при нефротическом синдроме, при массивных ожогах, патологии желудочно-кишечного тракта Снижается абсолютное содержание общего белка и особенно альбумина, при относительно равномерном возрастании всех глобулинов. • Введение белковых препаратов (иммуноглобулины, альбумин или плазма крови) в ходе лечения больных немедленно отражается на электрофоретической картине, что позволяет следить за динамикой потерь или выведения поступивших белков.

Тяжелый иммунодефицит • Тяжелый иммунодефицит врожденный или приобретенный обычно сопровождается выраженным снижением g-глобулиновой фракции. • При этом желательно провести дополнительное количественное определение Ig. G, Ig. A и Ig. M.

Парапротеины • Термин парапротеин была введен в 1940 году Апитцем, и описывает патологические белки, которые вырабатываются клетками опухоли миеломы и определяются в крови, моче и тканях. • Парапротеины являются самыми ранними онко-маркерами и остаются неотъемлемой частью диагностики и мониторинга пациентов.

Парапротеинемия • при злокачественных и доброкачественных процессах накопливаютсянии в крови моноклональные иммуноглобулины или фрагментов их цепей. • при миеломной болезни и некоторых лейкозах, на протеинограмме появляется более или менее острый пик в области от a 2 - до g-глобулинов (так называемый М‑градиент), хорошо заметный визуально. • Электрофорез белков мочи, проведенный параллельно, в этом случае выявит пик, находящийся в той же области.

Электрофорез ДНК • Аналитический метод, применяемый для разделения фрагментов ДНК по размеру и заряду фрагмента. • Силы электрического поля, прикладываемого к образцам, заставляют фрагменты ДНК мигрировать через гель. • Сахарофосфатный остов молекул ДНК заряжен отрицательно и поэтому цепи ДНК двигаются от катода, заряженного отрицательно, к положительному аноду. • Более длинные молекулы мигрируют медленнее, так как задерживаются в геле, более короткие молекулы двигаются быстрее. По пробегу можно отличить фрагменты отличающиеся на один нуклеотид

• К образцам обычно добавляют низкомолекулярный кислый краситель динитрофенол или бромфеноловый синий. • чтобы можно было наблюдать за движением фрагментов.

Рестриктазы и липкие концы

• Полиморфизм длин рестриктов (ПДР, — это способ исследования геномной ДНК, путем разрезания ДНК с помощью рестриктаз и дальнейшего анализа размеров образующихся фрагментов (рестриктов) путем гель-электрофореза. • Анализ разнообразия ПДР является важным инструментом в картировании генома, локализации генов, ответственных за генетические заболевания, определения риска заболевания, получения генетических отпечатов и определения родства. Идентификация людей.

• Блоттингом называют перенос фрагментов макромолекул (ДНК, РНК или белка), разделенных с помощью электрофореза в геле, на твердую подложку - мембрану. нитро -целлюлозную ии ацетил-целлюлозную • В исследованиях генома человека часто используют метод блоттинга, разработанный Саузерном, при котором олигонуклеотидный зонд, находящийся в растворе, гибридизуется с ДНК, адсорбированной на мембране.

• Электрофорез проводится в камере, заполненной буферным раствором. Чаще всего используются буферы, содержащие ЭДТА, трис или борную кислоту. • Буфер необходим для повышения ионной силы раствора, в котором будет происходить разделение молекул ДНК под действием приложенного электрического поля. • Для того, чтобы прочесть электрофореграмму добавляют люминисцентный краситель.

Применение электрофореза в полиакриламидном геле. 1. Полиморфизмма длин рестриктов, 2. Полимеразная цепная реакция, 3. Секвенированию генов (по Сенгеру).

Полимеразная цепная реакция • Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro).

• Дезоксинуклеотидный метод, или метод «обрыва цепи» , был разработан Ф. Сенгером в 1977 году и в настоящее время широко используется для определения нуклеотидной последовательности ДНК. При дидезокси-секвенировании происходит гибридизация синтетического олигонуклеотида длиной 17— 20 звеньев со специфическим участком одной из цепей секвенируемого участка. Этот олигонуклеотид является праймером, поставляющим 3'-гидроксильную группу для инициации синтеза цепи, комплементарной матрице.

• Раствор с праймером распределяют по четырем пробиркам, в каждой из которых находятся четыре дезоксинуклеотида, d. ATP, d. CTP, d. GTP и d. TTP (один из них — меченный радиоактивным изотопом) и один из четырех 2', 3'-дидезоксинуклеотидов (dd. ATP, dd. TTP, dd. GTP или dd. CTP). Дидезоксинуклеотид включается по всем позициям в смеси растущих цепей, и после его присоединения рост цепи сразу останавливается.

• В результате этого в каждой из четырех пробирок при участии ДНК-полимеразы образуется уникальный набор олигонуклеотидов разной длины, включающих праймерную последовательность. Далее в пробирки добавляют формамид для расхождения цепей и проводят электрофорез в полиакриламидном геле на четырех дорожках. Проводят радиоавтографию, которая позволяет «прочесть» нуклеотидную последовательность секвенируемого сегмента ДНК.