ЭЛЕКТИВЫ ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н. И. Пирогова МЗ России Основы лабораторной диагностики сифилиса на современном этапе Москва, 02. 12. 2015 г. Ротанов Сергей Владимирович д. м. н. , доцент ФГБУ “ГНЦДК” Минздрава России, г. Москва ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н. И. Пирогова Минздрава России, г. Москва
Венерические заболевания Сифилис Мягкий шанкр Гонорея Четверная венерическая болезнь или паховый лимфогранулёматоз ИППП Сифилис Гонорея Хламидиоз Трихомоноз Шанкроид (мягкий шанкр) Уреаплазменная (микоплазменная) инфекция Генитальный герпес Аногенитальные бородавки ВИЧ-инфекция (СПИД)
КЛАССИФИКАЦИЯ ИППП ПО МКБ-Х Класс I - Некоторые инфекционные и паразитарные болезни Класс II - Новообразования Класс III - Болезни крови, кроветворных органов и отдельные нарушения, вовлекающие иммунный механизм Класс IV - Болезни эндокринной системы, расстройства питания и нарушения обмена веществ Класс V - Психические расстройства и расстройства поведения Класс VI - Болезни нервной системы Класс VII - Болезни глаза и его придаточного аппарата Класс VIII - Болезни уха и сосцевидного отростка Класс IX - Болезни системы кровообращения Класс X - Болезни органов дыхания Класс XI - Болезни органов пищеварения Класс XII - Болезни кожи и подкожной клетчатки Класс XIII - Болезни костно-мышечной системы и соединительной ткани Класс XIV - Болезни мочеполовой системы Класс XV - Беременность, роды и послеродовой период Класс XVI - Отдельные состояния, возникающие в перинатальном периоде Класс XVII - Врожденные аномалии, деформации и хромосомные нарушения Класс XVIII - Симптомы, признаки и отклонения от нормы, выявленные при клинических и лабораторных исследованиях, не классифицированные в других рубриках Класс XIX - Травмы, отравления и некоторые другие последствия воздействия внешних причин Класс XX - Внешние причины заболеваемости и смертности Класс XXI - Факторы, влияющие на состояние здоровья населения и обращения в учреждения здравоохранения
КЛАССИФИКАЦИЯ ИППП ПО МКБ-Х Класс I: Некоторые инфекционные и паразитарные болезни Блок (A 00 -A 09) Блок (A 15 -A 19) Блок (A 20 -A 28) Блок (A 30 -A 49) - Кишечные инфекции Туберкулез Некоторые бактериальные зоонозы Другие бактериальные болезни Блок (A 50 -A 64) - Инфекции, передаваемые преимущественно половым путем Блок (A 65 -A 69) Блок (A 70 -A 74) Блок (A 75 -A 79) Блок (A 80 -A 89) Блок (A 90 -A 99) Блок (B 00 -B 09) Блок (B 15 -B 19) Блок (B 20 -B 24) Блок (B 25 -B 34) Блок (B 35 -B 49) Блок (B 50 -B 64) Блок (B 65 -B 83) Блок (B 85 -B 89) Блок (B 90 -B 94) Блок (B 95 -B 97) Блок (B 99) - Другие болезни, вызываемые спирохетами Другие болезни, вызываемые хламидиями Риккетсиозы Вирусные инфекции центральной нервной системы Вирусные лихорадки, передаваемые членистоногими, и вирусные геморрагические лихорадки Вирусные инфекции, характеризующиеся поражениями кожи и слизистых оболочек Вирусный гепатит Болезнь, вызванная вирусом иммунодефицита человека [ВИЧ] Другие вирусные болезни Микозы Протозойные болезни Гельминтозы Педикулез, акариаз и другие инфестации Последствия инфекционных и паразитарных болезней Бактериальные, вирусные и другие инфекционные агенты Другие инфекционные болезни
КЛАССИФИКАЦИЯ ИППП ПО МКБ-Х Класс: Некоторые инфекционные и паразитарные болезни Блок: Инфекции, передаваемые преимущественно половым путем А 50. 0 - 50. 9 Врожденный сифилис (клинические формы) А 50. 0 - 50. 9 А 51. 0 - 50. 9 Ранний сифилис (клинические формы) А 51. 0 - 50. 9 А 52. 0 - 52. 9 Поздний сифилис (клинические формы) А 52. 0 - 52. 9 А 53. 0 - 53. 9 Другие неуточненные формы сифилиса А 53. 0 - 53. 9 А 54. 0 - 54. 9 Гонококковая инфекция (клинические формы) А 54. 0 - 54. 9 А 55 Хламидийная лимфогранулема (венерическая) А 56. 0 - 56. 9 Другие хламидийные болезни, передаваемые половым А 56. 0 - 56. 9 путем А 57 Шанкроид (мягкий шанкр) А 58 Паховая гранулема А 59. 0 - 59. 9 Трихомоноз А 59. 0 - 59. 9 А 60. 0 - 60. 9 Аногенитальная герпетическая вирусная инфекция А 60. 0 - 60. 9 [herpes simplex] А 63 Другие болезни, передаваемые преимущественно половым путем, не классифицированные в других рубриках А 64 Болезни, передаваемые половым путем, неуточненные
Количество новых случаев ИППП в разных регионах мира по данным ВОЗ (2013 год) 22 млн 14 млн 17 млн 10 млн 38 млн 151 млн 69 млн 1 млн 333 852 случаев ИППП в 2013 г. 350 300 250 337. 8 200 150 100 Заболеваемость ИППП в России (на 100 000 населения) 300. 6 267. 9 233. 4 50 0 2011 2012 2013 2014 2015
ВЛИЯНИЕ ИППП НА ДЕМОГРАФИЧЕСКУЮ СИТУАЦИЮ ИППП поражают в основном молодых, сексуально активных людей ИППП снижают качество жизни ИППП – причина: бесплодия невынашивания беременности младенческой смертности Нарушают репродуктивное здоровье нации и воспроизведение численности населения
ПОСТАНОВЛЕНИЕ ПРАВИТЕЛЬСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ № 715 ОТ 1 ДЕКАБРЯ 2004 Г. « УТВЕРЖДЕНИИ ПЕРЕЧНЯ ОБ СОЦИАЛЬНО ЗНАЧИМЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И ПЕРЕЧНЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ПРЕДСТАВЛЯЮЩИХ ОПАСНОСТЬ ДЛЯ ОКРУЖАЮЩИХ» перечень социально значимых заболеваний А 15 -19 А 50 - 64 туберкулёз инфекции, передаваемые преимущественно половым путем В 16 -18. 0 -18. 1 гепатит В В 17. 1 -18. 2 гепатит С В 20 -24 болезнь, вызванная вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) С 00 -97 злокачественные новообразования Е 10 -14 сахарный диабет F 00 -99 психические расстройства и расстройства поведения I 10 -13. 9 болезни, характеризующиеся повышенным кровяным давлением
ПОСТАНОВЛЕНИЕ ПРАВИТЕЛЬСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ № 715 ОТ 1 ДЕКАБРЯ 2004 Г. « УТВЕРЖДЕНИИ ПЕРЕЧНЯ ОБ СОЦИАЛЬНО ЗНАЧИМЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И ПЕРЕЧНЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ПРЕДСТАВЛЯЮЩИХ ОПАСНОСТЬ ДЛЯ ОКРУЖАЮЩИХ» перечень заболеваний, представляющих опасность для окружающих В 20 - 24 болезнь, вызванная вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) А 90 - 99 вирусные лихорадки, передаваемые членистоногими, и вирусные геморрагические лихорадки В 65 - 83 гельминтоз В 16 -18. 0 -В 18. 1 гепатит В В 17. 1 -18. 2 гепатит С А 36 дифтерия А 50 – 64 инфекции, передаваемые преимущественно половым путём А 50 – 64 А 30 лепра В 50 - 54 малярия В 85 - 89 педикулёз, акариаз и другие инфестации А 24 сап и мелиоидоз А 22 сибирская язва А 15 - 19 туберкулёз А 00 холера А 20 чума
РАНГОВОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ЗАБОЛЕВАЕМОСТИ ППП ИППП И НАСЕЛЕНИЯ РОССИИ ЗА 2003 -2013 ГОДЫ (НА 100 000 НАСЕЛЕНИЯ) 260. 9 0. 0 245. 4 215. 5 199. 5 0. 0 186. 3 167. 5 0. 0 144. 7 126. 8 111. 4 0. 0 101. 0 82. 0 95. 2 102. 0 82. 5 0. 0 94. 1 79. 4 68. 8 31. 6 79. 2 19. 6 21. 3 0. 0 2003 2004 21. 8 2005 уроген. герпес 2006 65. 2 80. 3 63. 1 33. 5 23. 6 22. 1 33. 9 23. 0 2008 56. 4 34. 3 34. 7 20. 8 2009 аногенит. бородавки 71. 0 59. 9 60. 8 63. 7 2007 91. 1 89. 6 71. 7 32. 1 32. 9 97. 2 96. 1 2010 53. 3 48. 1 42. 7 32. 7 19. 8 18. 3 2011 гонорея 65. 9 37. 6 44. 9 29. 2 38. 2 26. 0 16. 8 2012 61. 4 33. 1 53. 1 28. 9 36. 4 23. 7 29. 8 15. 4 2013 сифилис хламидиоз трихомоноз
Сифилис является антропонозной инфекцией, вызываемой Treponema pallidum, с преимущественно половым путём передачи инфекционного агента, с характерной периодизацией развития и проявления клинических признаков, склонной к хроническому рецидивирующему прогредиентному течению, способное поражать все ткани и все системы органов
ДИНАМИКА ЗАБОЛЕВАЕМОСТИ СИФИЛИСОМ В ОССИИ Р (ЧИСЛО СЛУЧАЕВ НА 100 ТЫС. НАСЕЛЕНИЯ) European Region 11. 6 Russian Federation 28. 9 ЗАБОЛЕВАЕМОСТЬ СИФИЛИСОМ В СТРАНАХ ЕВРОПЫ (НА 100 000 НАСЕЛЕНИЯ 2013 ГОД) Source: WHO/Europe, European HFA Database, July 2013 <= 80 <= 64 <= 48 <= 32 <= 16 no data
ЭТИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКТОР Возбудителем сифилитической инфекции является T. pallidum, открытая F. Sсhaudinn и E. Hoffmann 3 марта 1905 года немецкий протистозоолог Fritz Schaudinn (1871 -1906) немецкий дерматовенеролог Paul E. Hoffmann (1968 -1959)
ТАКСОНОМИЯ T. PALLIDUM порядок Spirochaetales семейство Spirichaetaceae род Treponema вид T. pallidum подвид pallidum (Schaudinn et Hoffmann, 1905) (возбудитель сифилиса) pertenue (Castellani, 1905) (возбудитель фрамбезии) endemicum (возбудитель эндемического сифилиса, беджели) carateum (возбудитель пинты)
МОРФОЛОГИЯ T. PALLIDUM микроорганизм спиралевидной формы с завитками одинаковыми по высоте и расстоянию между ними длина T. pallidum от 4 до 16 мкм, толщина в поперечнике 0, 2 -0, 25 мкм, концы заострены количество завитков от 8 до 12, но может значительно варьировать в различные периоды жизненного цикла микроорганизма ближе к концам завитки имеют меньшую высоту и большее расстояние между ними
МОРФОЛОГИЯ T. PALLIDUM
ОКРАСКА T. PALLIDUM для изучения морфологии микроорганизма наилучшим методом окраски является окраска по Романовскому -Гимзе (T. pallidum - бледно-розового цвета, другие трепонемы - более темного цвета с синим или фиолетовым оттенком) серебрение по Морозову – цвет коричневый или почти черный
ОКРАСКА T. PALLIDUM D B A S. Vincenti-Piauti и B. fusiformis T. pallidum C S. intestinalis в смеси с холерным вибрионом S. Obermeyeri
В работах отечественных ученых (ГНЦДК) Н. М. Овчинникова, В. В. Делекторского была подробно описана морфология бледной трепонемы, определены её размеры и структура, описаны: клеточная стенка, фибриллы, блефаропласты и другие компоненты, описаны цисты и L-формы возбудителя сифилиса
РАЗМНОЖЕНИЕ T. PALLIDUM путем поперечного деления х 150 000 х 50 000
РАЗМНОЖЕНИЕ T. PALLIDUM путем образования гранул, зерен половой путь
ФОРМЫ СУЩЕСТВОВАНИЯ T. PALLIDUM х 10 000 извитая цисты х 44 000 х 60 000 зерна и гранулы L-формы х 20 000 х 21 000
ГЕНОМ БЛЕДНОЙ ТРЕПОНЕМЫ В 1998 году группой исследователей из США [С. M. Fraser et al. ] был расшифрован геном T. pallidum. Полная нуклеотидная последовательность генома T. pallidum составляет 1138 006 п. н. о. Геном микроорганизма включает 42 семейства генов, ответственных за основные жизнеобеспечивающие функции механизмы репликации, транскрипции, трансляции ДНК, энергетический метаболизм, процессы клеточного деления и секреции белков. В геноме отсутствует ген rec. A, ответственный за генетическую рекомбинацию и восстановление поврежденной ДНК, что объясняет высокий консерватизм генома. TAGATGGACGCAGTAGGGTATG AAGTATTCTGGAACGAGACACTC AGCCAGATACGGAGTGAATCGA CCGATTTAACATGTGGTTTGCTC ATTTGTTCTTTATCGCATCTTTT GAAAACGCTATCGAAATAGCCA GACTTTTTCCGAATACAGTTTAG CCAAAAATATCAAGAAAAGCTTG AGCGCAAGTTCCTCAACTTTCTG GACACCCCATTAACTTTTG CCGTTAAAAAAGGCACCCCTC
ГЕНОМ БЛЕДНОЙ ТРЕПОНЕМЫ Бледная трепонема - облигатный паразит, что обусловлено небольшим размером генома, лимитирующим обеспечение некоторых процессов биосинтеза собственными силами, в частности синтеза липидов; микроорганизм в ходе эволюции приспособился выживать исключительно за счёт организма хозяина. В этой связи, важную роль в её жизнедеятельности играет транспорт необходимых питательных веществ из окружающей среды, что обусловливает присутствие широкого репертуара транспортных белков с большим выбором субстратных специфичностей.
ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ T. PALLIDUM факультативный анаэроб, микроаэрофил характерен упрощенный метаболизм (облигатный паразит) плохо культивируется на искусственных питательных средах, при культивировании теряет свойство патогенности экспериментальный сифилис температурный оптимум существования 35 -37 С высокая чувствительность к АМП, p. H среды медленный рост и длительные периоды покоя между делениями клетки
ВИДЫ ДВИЖЕНИЙ . PALLIDUM T вращательное (ротаторные) - вокруг продольной оси, благодаря чему микроорганизм «ввинчивается» в структуру тканей поступательное - продвижение вперед и назад контрактильное - волнообразные колебания, пробегающие по всему телу микроорганизма сгибательное - в различных направлениях под острым углом, благодаря чему могут наблюдаться V-образные фигуры маятникообразное (качательное, бичеобразное) - в случае прикрепления одним концом к неподвижному плотному субстрату
ПЕРИОДЫ ТЕЧЕНИЯ СИФИЛИТИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИИ инкубационный (0 - 3 -4 недели) первичный (3 -4 недели - 2 -2, 5 месяца) вторичный (2, 5 месяца - 2 -5 лет) третичный (3 -5 лет - и более) КЛИНИЧЕСКИЕ ФОРМЫ СИФИЛИТИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИИ: : Сифилис кожи и видимых слизистых оболочек Кардиоваскулярный сифилис Сифилис с поражением паренхиматозных органов Нейросифилис Сифилис с поражением опорно-двигательного аппарата
ДИАГНОСТИКА СИФИЛИТИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИИ: жалобы анамнез данные клинического осмотра контфронтация результатов обследования половых партнёров результаты лабораторных исследований результаты инструментального обследования путем проведения пробного лечения
Лабораторные методы, применяемые для диагностики сифилитической инфекции Прямые методы детекция возбудителя Treponema pallidum или его генетического материала Непрямые методы иммунохимические, основанные на определении антител к наиболее специфичным антигенам Treponema pallidum
Методы, используемые для установления окончательного диагноза при инфекционных заболеваниях (в том числе и при сифилисе) – прямые тесты
Прямые методы детекции T. pallidum: методы детекции микроскопия в тёмном поле (ТПМ) реакция прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) патоморфологические исследования окраска по Романовскому Гимзе серебрение по Морозову окраска ПИФ молекулярно-генетические исследования (МАНК): полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Прямые методы детекции T. pallidum: методы детекции микроскопия в тёмном поле (ТПМ) реакция прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) патоморфологические исследования окраска по Романовскому Гимзе серебрение по Морозову окраска ПИФ молекулярно-генетические исследования (МАНК): полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Материал для прямых методов определения T. pallidum райц-серум (применимо для диагностики первичного, вторичного и раннего врожденного сифилиса); пунктат увеличенных регионарных лимфатических узлов; цереброспинальная жидкость (ликвор) (при подозрении на нейросифилис исследуют осадок, полученный при центрифугировании образца); при врожденном сифилисе исследуют амниотическую жидкость, межтканевую жидкость из ткани плаценты или серозный материал из пузырных элементов на коже новорожденного
Исследование райц-серума Метод раздражения - поверхность эрозивного или язвенного дефекта очищают тампоном, смоченным стерильным физ. раствором; стерильной ложкой Фолькмана производят осторожные, поглаживающие движения по поверхности элементов, избегая повреждения сосудов; поверхность становится блестящей в результате просачивания тканевой жидкости, которую собирают на предметное стекло или в микропробирку. Метод сдавливания - после очистки поверхности эрозии или язвы твердый шанкр или папулезный элемент в основании сдавливают с боков пальцами или пинцетом. Сдавливание тканей стимулирует выделение серозного экссудата, который накапливается на поверхности морфологического элемента. Метод скарификации - поверхность сухих элементов (розеол или папул) скарифицируют иглой для взятия крови хирургическим скальпелем, останавливают капиллярное кровотечение, затем методом раздражения поверхности получают серозную жидкость Комбинирование методов раздражения и сдавливания.
Темнопольная микроскопия (ТПМ) Объекты исследования проявления первичного и вторичного сифилиса на коже и видимых слизистых оболочках поражения при раннем врождённом сифилисе поражения при Lues III (материал из глубины инфильтрата или со дна язвы) увеличенные регионарные лимфатические узлы Спинномозговая жидкость Амниотическая жидкость
Морфологическая характеристика различных трепонем Признаки T. pallidum ssp. pallidum Число завитков 8 -12 (интервал) (6 -20) Длина, мкм (интервал) Толщина, мкм Длина завитка, мкм Глубина завитка, мкм T. refringens T. phagedenis (reiteri) T. denticola 2 -3 10 -12 (10 -30) 6 -8 10 (4 -16) 5 -8 (5 -16) 10 -12 (10 -30) 8 (6 -16) 0, 13 -0, 35 0, 2 -0, 3 0, 2 -0, 25 0, 15 -0, 2 1, 1 1, 8 1, 4 -1, 6 0, 9 0, 5 -0, 7 0, 2 -0, 3 0, 1 -0, 4
Виды движений различных трепонем Виды движений Tr. pallidum ssp. pallidum Tr. refringens Tr. phagedenis (Tr. reiteri) Tr. denticola поступательное медленное, свободное быстрое медленное, свободное, c резкими толчками медленное, свободное вращательное от медленного к быстрому, может вращаться на месте очень быстрое от медленного к быстрому, вращается на месте от медленного к быстрому, часто с резки-ми толчками волнообразное мягкое, равномерное с выраженными изгибами колебательное, с резкими толчками мягкое, крутящееся колебательное нет сгибательное имеется нет, иногда отмечается движение на концах маятникообразное имеется нет
Прямая иммунофлюоресценция Принцип метода: в результате взаимодействия моноклональных анти-T. pallidum антител, меченных ФИТЦ, и бледной трепонемы при люминесцентной микроскопии наблюдается специфическое ярко-зеленое свечение Преимуществом ПИФ перед темнопольной микроскопией возможность дифференцировки патогенных трепонем от непатогенных при исследовании материала с проявлений на слизистых оболочках полости рта и прямой кишки, может быть использован материал, полученный при биопсии или аутопсии
Прямые методы детекции T. pallidum: методы детекции 0, 10% микроскопия в тёмном поле (ТПМ) реакция прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) патоморфологические исследования окраска по Романовскому Гимзе 0% серебрение по Морозову окраска ПИФ ? % молекулярно-генетические исследования (МАНК): полимеразная цепная реакция (ПЦР) 0, 01%
Ограничения в применении прямых методов определения T. pallidum низкие показатели аналитической чувствительности ряда методик исследования (ТПМ, ПИФ), что обусловлено малым количеством копий возбудителя в образцах клинического материала, фоновым влиянием другого генетического материала в исследуемой пробе; отсутствие возможности получить клинический материал для исследования при скрытых клинических формах инфекции; отсутствие методик выявления и идентификации измененных форм возбудителя (цисты, L-формы, зёрна);
перспективные разработки - детекция T. pallidum с помощью протеомных технологий Существующие методы прямого обнаружения возбудителя сифилиса не всегда позволяют дать ответ о наличии T. pallidum в очаге : В этих условиях перспективным для диагностики может явиться разработка протеомного профилирования бледной трепонемы Технология, позволяет исследовать экспрессию, локализацию и взаимодействие белков в клетке возбудителя заболевания с целью выявления и инвентаризации уникальных белков, закодированных в геноме исследуемого микроорганизма Основной методом протеомного анализа масс-спектрометрия, позволяющая определять массу и заряд исследуемых белков с их последующей идентификацией по библиотекам данных получаемый белковый спектр является уникальной характеристикой патогена
Непрямые методы диагностики сифилиса (иммунохимические, серологические) основаны на определении в жидких средах организма пациентов антител против специфических антигенов возбудителя; биологическим материалом служат: сыворотка / плазма крови или ликвор; применимы для диагностики всех клинических форм сифилиса, а также для КСК состояния здоровья пациентов после проведения специфического лечения Непрямые иммунохимические исследования для диагностики сифилиса Нетрепонемные тесты (НТТ) Трепонемные тесты (ТТ)
Реакция Вассермана – 1906 год важной вехой в развитии методов лабораторной диагностики сифилиса явилось применение в 1906 году А. Вассерманом совместно с А. Neisser и C. Bruck реакции связывания комплемента (РСК) для определения антител к T. pallidum Аlfred fon Wasserman
Отрицательные черты реакции Вассермана трудоемкий метод исследования использует субъективный подход к интерпретации результатов исследования метод, нередко дающий ложные отрицательные и положительные результаты метод, не подлежащий стандартизации, автоматизации и протоколированию результатов метод, не подлежащий внешнему контролю качества отдавая должное исторической роли реакции, предложенной А. Вассерманом, А. Нейссером и С. Бруком, в настоящее время этот метод оценивается как морально устаревший
Нетрепонемные тесты: общая характеристика применяется антиген нетрепонемного происхождения; выявляют гетерофильные Ig. M и Ig. G к липидам, входящим в структуру T. рallidum или образующимся при деструкции тканей организма хозяина (что снижает специфичность результатов исследования); определяемые антитела появляются в крови больных сифилисом через 1 -2 недели после развития твердого шанкра; клиническая чувствительность тестов– 59– 100%; клиническая специфичность – 93 -99%. Преимущества: низкая себестоимость, простота технического выполнения, возможность проведения единичных исследований за короткий промежуток времени. Недостатки: низкая клиническая чувствительность при сифилисе первичном (59 -87%) и позднем (37 -85%); возможность получения ложно положительных результатов, отсутствие автоматизации и субъективный характер оценки результатов.
Флоккуляционные нетрепонемные тесты (принципы осуществления) при добавлении к образцу (сыворотке/плазме крови или ликвору) больного сифилисом кардиолипинового антигена: холестерол 0, 98% + кардиолипин 0, 03% + лецитин 0, 28% (M. Pangborn, 1941; Л. С. Резникова, 1956) происходит образование комплексов антиген-антитело в виде рыхлого осадка – флоккулята (преципитата), состоящего из мелких хлопьев белого цвета для улучшения визуализации образования осадка в разных модификациях теста - к антигену добавляют частицы древесного угля (RPR) или красителей (толуидиновый красный - TRUST, судан черный – RST, ); - учет результатов осуществляют с 2 -х лупой (RPR, РМП) или под микроскопом (VDRL, USR); выпускается готовый к использованию антиген, стабилизированный ЭДТА (USR) или мертиолятом (Люис-тест).
Нетрепонемные тесты Разрешены к применению в РФ наборы реагентов РМП – реакция микропреципитации с плазмой или РМП 43, 57% инактивированной сывороткой крови «Сифилис-Аг. КЛ-РМП» ЗАО «ЭКОлаб» (г. Электрогорск Московская обл. , Россия) «Антиген кардиолипиновый для РМП, раствор для диагностических целей» ФГУП «НПО «Микроген» (г. Москва, Россия) «ЛЮИС-ТЕСТ» Набор 1 и 2» ООО «НПО «Диагностические системы» (г. Н. Новгород, Россия) RPR – быстрый плазмареагиновый тест (Raped Plasma Reagin) 3, 53% «Сифилис RPR-тест» ЗАО «ЭКОлаб» ( г. Электрогорск Московской обл. , Россия) «Люиc RPR тест» ООО «НИАРМЕДИК ПЛЮС» (г. Москва, Россия) «SYPHILIS RPR TEST» фирма «NEWMARKET LABORATORIES» (Великобритания) «SYPHILIS RPR TEST» фирма «Human Gmb. H» (Wiesbaden, Германия) VDRL – Venereal Diseases Research Laboratory Test (флоккуляционный тест с VDRL антигеном) ? % «Сифилис-VDRL-тест» ЗАО «ЭКОлаб» (г. Электрогорск Московской обл. , Россия)
Проведение исследования в РМП перенос 90 (150) мкл разведения образца сыворотки внесение 90 (150) мкл образца сыворотки крови внесение в каждую лунку по 1 капле суспензии кардиолипинового антигена цельная 1: 2 Нетрепонемные тесты 1: 4 1: 8 1: 16 1: 32 1: 64 1: 128 1: 256 внесение 90 (150) мкл изотонического раствора Na. Cl 1: 512
Приготовление антигена для проведения реакции РМП – реакция микропреципитации с плазмой и инактивированной сывороткой крови высаливание Ag в физиологич. растворе осаждение Ag при центрифугировании ресуспендирование Ag в 30% растворе холинахлорида время приготовления Ag 45 -60 минут контроль качества приготовленного Ag с контрольными сыворотками набор реагентов « Сифилис-Аг. КЛ-РМП» комплект 1 производства ЗАО «ЭКОлаб» (г. Электрогорск Московской области)
Приготовление антигена для проведения реакции РМП – реакция микропреципитации с плазмой и инактивированной сывороткой крови ресуспендирование готового к использованию Кл Аг производственного приготовления контроль качества суспензии Кл Аг с контрольными сыворотками, входящими в состав набора реагентов набор реагентов « Сифилис-Аг. КЛ-РМП» комплект 2 производства ЗАО «ЭКОлаб» (г. Электрогорск Московской области)
Нетрепонемные тесты Проведение исследования в RРR RPR TEST 1 1 6 2 7 3 8 4 9 2 3 6 7 8 4 5 5 10 К+ 1 перенос 50 мкл разведения образца сыворотки внесение 50 мкл образца сыворотки крови внесение в каждую лунку по 16 мкл суспензии цельная RPR-кардиолипинового антигена положительный и отрицательный результат результат К- 1: 2 1: 4 1: 8 1: 16 1: 32 1: 64 1: 128 внесение 50 мкл изотонического раствора Na. Cl 1: 256 1: 512
Виды рекомендуемых нетрепонемных тестов RPR (Rapid Plasma Reagins) – быстрый плазмареагиновый тест антиген готовый к применению компоненты длительного хранения наличие контрольных сывороток с известной активностью набор реагентов «Сифилис-RPR-тест» производства ЗАО «ЭКОлаб» (г. Электрогорск Московской области)
Показания к применению Нетрепонемные тесты проведение скрининга населения на сифилис с целью выявления активных форм течения инфекции; оценка активности гуморального иммунного ответа у больных сифилисом (по уровню содержания реагиновых антител); контроль эффективности проведения специфического лечения (по динамике снижения титра антител в сыворотке крови – снижение титра не менее, чем в 4 раза от исходного в течение 1 года).
Трепонемные тесты Трепонемные тесты (принципы осуществления) при добавлении к сыворотке/плазме крови или ликвору больного сифилисом трепонемного антигена в виде: - живой или фиксированной T. pallidum (РИБТ, РИФ); РИБТ РИФ - фрагментов разрушенной ультразвуком патогенной T. pallidum, или рекомбинантного целевого белка, сорбированных на эритроцитах (РПГА) или желатиновых частицах (ТР-РА); РПГА ТР-РА - специфических для T. pallidum рекомбинантного или биосинтетического антигенов, сорбированных на твердой фазе (ИФА, ИБ, ИХЛА, ИХр. А, проточная флюорометрия, ИФА ИБ ИХЛА ИХр. А проточная флюорометрия исследование на белковых биочипах) биочипах происходит образование иммунных комплексов, которые выявляются при использовании разных методических подходов
Трепонемные тесты Рекомендации по применению 0, 09% РИБТ (РИТ) – реакция иммобилизации бледных трепонем РИБТ (РИТ) - классический тест для выявления специфических трепонемных антител; - сложный тест, требующий значительных затрат на содержание лабораторных кроликов и морских свинок; - длительность проведения исследования. Чувствительность (суммарно по всем стадиям сифилиса) составляет 87, 7%; специфичность -100%. Показания к применению: подтверждающий тест на сифилис; применяется в референс-лабораториях. Ограничения применения: тест недостаточно чувствителен на ранних стадиях заболевания; сложен в постановке и интерпретации, трудоемок, используется субъективный элемент в оценке результатов.
Трепонемные тесты Разрешены к применению в РФ наборы реагентов 1, 36% РИФ – реакция иммунофлуоресценции РИФ (FTA - Fluorescent treponemal antibody) «Люми. Бест» ЗАО «Вектор-Бест» (пос. Кольцово Новосибирской обл. , Россия) «Антипаллидум. Флюороген-Ig. M/Ig. G» ЗАО «ЭКОлаб» (г. Электрогорск Московской обл. , Россия) Рекомендации по применению РИФ (в особенности РИФабс) принята в качестве «золотого стандарта» среди ТТ Чувствительность при первичном сифилисе - 70 -100%, при вторичном и позднем - 96 -100%, специфичность – 94 -100% Показания к применению: подтверждающий тест Ограничения применения: не используется при скрининге больных ввиду трудоемкости, необходим флуоресцентный микроскоп, применяется субъективный фактор оценки результатов.
Получение рекомбинантных антигенов и синтетических пептидов Знания о возбудителе сифилиса были значительно расширены после разработки генно-инженерных технологии производства рекомбинантных антигенов и получения пептидов, путём прямого биохимического синтеза в структуре T. pallidum выделяют большое количество антигенов с молекулярной массой от 15 до 97 к. Da, из которых от 7 до 15 относят к высоко специфичным для этого возбудителя, в то время как другие антигены нередко проявляют перекрестную реактивность с трепонемами других видов, боррелиями и лептоспирами. высоким иммунным ответом при всех клинических формах и стадиях сифилиса характеризуются антигены Tp. N 15, 17, 39, 41, 42 -44, 47 и некоторые другие, что позволило оптимизировать серологическую диагностику сифилиса Синтез рекомбинантных антигенов
антиген Tp. N 15 Белок Tp. N 15 присутствует в структуре T. pallidum, а также T. pallidum subsp. pertenue (возбудитель фрамбезии), но не обнаруживается у непатогенной T. pallidum biotype Reiter. Гуморальный и клеточный иммунный ответ у больного сифилисом на этот антиген развивается позднее, чем на другие антигены. чувствительность тестов с использованием Tp. N 15 у больных 15 различными формами сифилиса варьирует в пределах 83 -100% антитела к нему не обнаруживаются в крови здоровых доноров антиген Tp. N 17 Антиген Tp. N 17 является липопротеином; высокое содержание Tp. N 17 его обнаруживается во внутренней мембране протоплазматического комплекса клетки T. pallidum, в небольших количествах этот антиген присутствует в структуре наружной мембраны этот антиген является высокоспецифичным для Т. pallidum и может быть использован для дифференциальной диагностики ложноположительных результатов серологических реакций на сифилис
антиген Tp. N 39 Полипептид Tp. N 39 является главной составляющей Tp. N 39 поверхностной мембраны Т. рallidum и играет важную роль в запуске иммунитета установлена выраженная реактогенность этого полипептида с образцами сыворотки крови больных первичным и вторичным сифилисом и её быстрое снижение после проведения им специфического лечения антибиотиками антиген Tmp. A Тmp. A является периплазматическим белком, участвующим в транспорте металлов через цитоплазматическую мембрану один из первых антигенов, использованных для диагностики сифилиса методом ИФА высокой а/г активностью характеризуется N-концевой фрагмент антигена, состоящий из 19 -и остатков аминокислот одинаково высокочувствителен и специфичен при диагностике сифилиса (95%) выявлена зависимость уровня антител к Tmp. A в сыворотке крови и эффективностью проведенной специфической терапии
антиген Tp. N 41 -42 является ферментом - цинк-зависимой карбоксипептидазой в больших количествах продуцируется патогенной Т. pallidum и не обнаруживается у трепонем-комменсалов чувствительность и специфичность ИФА с использованием этого антигена составляет не ниже 92, 5 и 90% соответственно.
Разрешены к применению в РФ наборы реагентов Трепонемные тесты 23, 08% ИФА – иммуноферментный анализ (ELISA – ИФА Enzyme Llinked Immunosorbent Assay) «ИФА-антипаллидум-скрин (антитела классов M, G, A)» «ИФА-антипаллидум-одностадийный (антитела классов M, G, A)» «ИФА-антипаллидум-Ig. M» «ИФА-антипаллидум-Ig. G» ЗАО «ЭКОлаб» (г. Электрогорск Московской области, Россия) «Рекомби. Бест антипаллидум - суммарные антитела» «Рекомби. Бест антипаллидум – Ig. G» «Рекомби. Бест антипаллидум – Ig. M» ЗАО «Вектор-Бест» (пос. Кольцово Новосибирской обл. , Россия) «ДС-ИФА-АНТИ-ЛЮИС-СУММАРНЫЕ АНТИТЕЛА» «ДС-ИФА-АНТИ-ЛЮИС-Ig. G» «ДС-ИФА-АНТИ-ЛЮИС-Ig. M» ООО «НПО «Диагностические системы» (г. Н. Новгород, Россия) «СИФ-ДСМ-суммарный» «СИФ-Ig. G-ДС-стрип «Инвитролоджик Сиф-АТ» «Инвитролоджик Сиф-Ig. M» ЗАО «Медико-биологический Союз» г. Новосибирск, Россия «ДРГ Трепонема-скрин ультра» ЗАО «ДРГ Техсистемс» (г. Москва, Россия) «Трепонема. Скрин» ЗАО БТК «Биосервис» (г. Боровск Калужской обл. , Россия)
Рекомендации по применению Трепонемные тесты ИФА - проводится как в ручном варианте, так и с помощью автоматических иммуноферментных анализаторов; - позволяет исследовать большие потоки образцов; - использует стандартизованные наборы реагентов; - клиническая чувствительность при первичном и вторичном сифилисе – 98 -100%, клиническая специфичность – 96 -100% Показания к применению: подтверждающий или скрининговый тест на сифилис
Применение рекомбинантных антигенов T. pallidum в составе иммуносорбентов для ИФА “Рекомби. Бест антипаллидум …” (ЗАО “Вектор-Бест”) – рекомбинантные белки, соответствующие основным иммунодоминантным антигенам T. pallidum pal “ДС-ИФА-АНТИ-ЛЮИС” (ООО НПО “Диагностические системы» ) – Tp 17, Tp 41, Tp 47 17 41 “ИФА антипаллидум-скрин” (ЗАО “ЭКОлаб”) - p 15, p 17, p 47 и p 15 p 17 Tmp. A “ДРГ Трепонема-скрин ультра” (фирма “DRG Technology”) – рекомбинантные белки, соответствующие основным иммунодоминантным антигенам T. pallidum “Трепонема. Скрин” (ЗАО БТК “Биосервис”) - p 15, p 17, p 47 и Tmp. A p 15 p 17 “ICE Syphilis” (фирмы Abbott-Murex) – Tp. N 15, Tp. N 17, Tp. N 47 “Syphilis EIA (II) TА Test Kits” (фирма “New. Market Lab. ) - Tp. N 15, Tp. N 17, Tp. N 47
Чувствительность ИФА при использовании отдельных рекомбинантных антигенов T. pallidum Стадии сифилиса Рекомбинантные антигены Tp. N 15 Tp. N 17 Tp. N 47 Tmp. A 62, 5% 71, 4% 97, 1% 88, 1% n=128 99, 2% 100% 99, 2% n=107 97, 8% 99, 1% 94, 4% 96, 3% все формы сифилиса 89, 3%4 92, 2%3 95, 6%1 95, 3%2 после лечения n=41 86, 2% 100% 56, 1% 48, 8% первичный n=84 вторичный латентный цит. по Чепурченко Н. В. и др. // Журнал Кл Дерматол и Венерол 2006; 2: 28 -31
Трепонемные тесты Разрешены к применению в РФ наборы реагентов 6, 75% РПГА – реакция пассивной гемагглютинации РПГА (ТРНА - Treponema pallidum hemagglutination assay) «Сифилис-РПГА-тест» ЗАО «ЭКОлаб» (г. Электрогорск Московской обл. , Россия) «TPHA 100» , «TPHA 200» и «TPHA 500» фирма «New. Market Lab. » или « 21 Lab Health. Care» (Великобритания) «Люис РПГА тест» ООО «НИАРМЕДИК ПЛЮС» (г. Москва, Россия) набор реагентов «Syphilis (TPHA) фирма «Randox» (Великобритания) «РПГА-БЕСТ антипаллидум» ЗАО «Вектор-Бест» (пос. Кольцово Новосибирской обл. , Россия) «ДС-РПГА-АНТИ-ЛЮИС» ООО «НПО «Диагностические системы» (г. Н. Новгород, Россия) «SYPHILIS TPHA liquid» фирма «Human Gmb. H» (Wiesbaden, Германия) TP-PA – Treponema pallidum partiсle agglutination assay TP-PA (реакция агглютинации сенсибилизированных частиц) «SERODIA® - TP·PA» фирма «Fujirebio» (Япония - Нидерланды)
Рекомендации по применению Трепонемные тесты РПГА и TP-PA - технически просты для постановки; - не требует специального оборудования; - не занимает много времени; - используются стандартизованные реагентов в коммерческих наборах; - может быть автоматизирован учет результатов теста и их архивирование Чувствительность при первичном сифилисе – 76%, при вторичном -100%, при скрытом - 94 -97%; Специфичность - 98 -100%. Показания к применению: подтверждающий или скрининговый тест на сифилис
Трепонемные тесты Относительно новые лабораторные технологии для диагностики сифилиса, разрешенные к применению в РФ ИБ – иммунноблоттинг (Western dlot) ИБ ИХА, ИХЛА – иммунохемилюминесцентный анализ ИХА ИХЛА (CLIA – Chemiluminescence immune assay) ИХр. А – иммунохроматографический анализ ИХр. А (Роint of care test) x. Map – проточная иммунофлюорометрия x. Map ИММУНОЧИП – технология исследования на ИММУНОЧИП белковых чипах
Трепонемные тесты Разрешены к применению в РФ наборы реагентов 0, 03% Иммуноблоттинг – Иммуноблоттинг линейный иммуноферментный анализ (Western blot) «Лайн-Блот Сифилис Ig. M / Ig. G» ЗАО «ЭКОлаб» (г. Электрогорск Московской обл. , Россия) «INNO Lia. TM Syphilis score» фирма «INNOGENETICS NV» (Gent, Бельгия) «Трепонема. Блот» ЗАО БТК «Биосервис» (г. Боровск Калужской обл. , Россия) «recom. Blot Treponems Ig. G» «recom. Blot Treponems Ig. M» фирма «Mikrogen ® Gmb. H» (Германия)
Трепонемные тесты Рекомендации по применению Иммуноблоттинг (Western Blot) – иммуносорбент представлен полосками (стрипами) с фиксированными на них рекомбинантными химерными белками T. pallidum – в реакции использован принцип линейного ИФА – проведение теста, учет и архивирование результатов могут быть автоматизированы Клиническая чувствительность и специфичность – 98 -100%. Показания к применению: подтверждающий тест на сифилис в случае, если другие ТТ дают сомнительные или дискордантные результаты. Ограничения применения: высокобюджетный метод исследования, требует значительного времени для постановки, квалифицированного персонала или автоматизированной станции.
РАСПОЛОЖЕНИЕ АНТИГЕНОВ INNO-LIA SYPHILIS В Tp. N 47 Tp. N 17 Tmp. A стрептавидин Контроли 3+ 1+ ± Tp. N 15 Антигены
Ограничения применения ТТ Трепонемные тесты ТТ не могут быть использованы для контроля эффективности специфического лечения, так как антитрепонемные антитела длительно циркулируют в организме больного, перенесшего сифилис. редко могут давать ложноположительные результаты у больных с аутоиммунными заболеваниями, проказой, онкологической и эндокринной патологией, а также при других заболеваниях, патологических и физиологических состояниях, боррелиозах и лептоспирозах; дают положительные результаты при тропических трепонематозах (вызываемых T. pertenue, T. carateum и T. begeli).
Проведение теста : добавление пробы 10 мкл сывороткм или плазмы крови в 1 мл растворителя и инкубация 14 -18 часов при комнатной температуре. контроли антитела к T. Pallidum антигены T. Pallidum
Проведение теста: после отмывания добавление конъюгата (козьи антитела к Ig. G человека, меченые щелочной фосфатазой) и инкубация 30 мин при комнатной температуре. Щелочная фосфатаза контроли антигены T. Pallidum антитела к Ig. G
Принцип теста : После отмывания добавление раствора субстрата (BCIP) и инкубация 30 мин при комнатной температуре. Развитие окраски останавливается серной кислотой. Субстрат BCIP контроли антигены T. Pallidum изменение окраски
Оценка результатов в INNO-LIA Syphilis Score отрицательный контроль положительный результат неопределенный результат отрицательный результат
Результаты определения диагностической эффективности иммуноблоттинга (тест-система INNO-Lia Syphilis Score) Клиническая чувствительность - 100% Клиническая специфичность - 98% Воспроизводимость результатов - 100%
Трепонемные тесты Разрешены к применению в РФ наборы реагентов 0, 09% ИХА, ИХЛА – иммунохемилюминесцентный анализ ИХА ИХЛА (CLIA – Chemiluminescence immune assay) «IMMULITE 2000 Syp» фирма «Simens» (Германия )
Схема иммунохемилюминесцентного исследования Субстрат, содержащий адамантила диоксетан Ig. G и Ig. M Bead with Ag Tp 17 и фермент Стадия взаимодействия иммуносорбента (Tp 17) с антителами, содержащимися в образце крови больного сифилисом, и антигеном Tp 17, конъюгированным с ферментом Стадия отмывания твердой фазы Активированное ферментом преобразование субстрата с выделением фотонов света
Трепонемные тесты Рекомендации по применению Иммунохемилюминесцентный анализ Клиническая чувствительность – (до лечения ) Lues I n= 49 97, 96 % Lues II n= 116 100% Lues latens n= 141 100% Всего n= 306 99, 68 % 99, 68 Клиническая специфичность - Здоровые доноры крови n=60 96, 67% Пациенты с БЛПР n=20 100% Всего n= 80 97, 50% 97, 50 Показания к применению: скрининговый и подтверждающий тест на сифилис в случае, если другие ТТ дают сомнительные или дискордантные результаты. Ограничения применения: требует существенных затрат на приобретение автоматического анализатора
Трепонемные тесты Разрешены к применению в РФ наборы реагентов ИХр. А – иммунохроматографический анализ (Роint of care test) 0% “Abbott Determine. TM Syphilis TP” “Иммуно. Хром-анти. ТР-Экспресс” “ИХА-анти-ТП-ФАКТОР” фирмы «Inverness Medical Japan Co. , Ltd. » , Япония (РУ № ФЗС 2009/05498) фирмы ООО «МЕД-ЭКСПРЕСС ДИАГНОСТИКА» , г. Москва, Россия (РУ № ФЗС 2008/02303) фирмы ООО «ФАКТОР-МЕД» , г. Москва, Россия (РУ № ФСР 2007/01604)
Трепонемные тесты ОПИСАНИЕ МЕДИЦИНСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ 2 этап Проведение иммунохроматографического исследования 3 этап Учет результатов исследования
Принцип проведения исследования Трепонемные тесты на иммунохроматографическом стрипе
Принцип проведения исследования Трепонемные тесты на иммунохроматографическом стрипе
Принцип проведения исследования Трепонемные тесты на иммунохроматографическом стрипе
Принцип проведения исследования Трепонемные тесты на иммунохроматографическом стрипе
Принцип проведения исследования Трепонемные тесты на иммунохроматографическом стрипе
Принцип проведения исследования Трепонемные тесты на иммунохроматографическом стрипе
Принцип проведения исследования Трепонемные тесты на иммунохроматографическом стрипе Y Антиген Tp + частицы коллоидного Se или Au Антитело
Принцип проведения исследования Трепонемные тесты на иммунохроматографическом стрипе Иммунный комплекс антиген Tp (+ частицы коллоидного Se или Au) и антитело человека Y
Принцип проведения исследования Трепонемные тесты на иммунохроматографическом стрипе Иммунный комплекс антиген Tp (+ частицы коллоидного Se или Au) и антитело Y
Принцип проведения исследования Трепонемные тесты на иммунохроматографическом стрипе Иммунный комплекс антиген Tp (+ частицы коллоидного Se или Au) и антитело Y
Принцип проведения исследования Трепонемные тесты на иммунохроматографическом стрипе Иммунный комплекс антиген Tp (+ частицы коллоидного Se или Au) и антитело YY
Принцип проведения исследования Трепонемные тесты на иммунохроматографическом стрипе Иммунный комплекс антиген Tp (+ частицы коллоидного Se или Au) и антитело антиген Tp, линейно фиксированный на твердой фазе YY Y
Принцип проведения исследования Трепонемные тесты на иммунохроматографическом стрипе Сложный иммунный комплекс YY Y
Принцип проведения исследования Трепонемные тесты на иммунохроматографическом стрипе Сложный иммунный комплекс Y Y Y
Принцип проведения исследования Трепонемные тесты на иммунохроматографическом стрипе Сложный иммунный комплекс YY Y
Принцип проведения исследования Трепонемные тесты на иммунохроматографическом стрипе тест контроль YY Y
Принцип проведения исследования Трепонемные тесты на иммунохроматографическом стрипе положительный результат исследования тест контроль отрицательный результат исследования контроль тест
Технология x. MAP (Multiple Analytes Profiling) x. MAP (проточная флюорометрия) использует суспензию гранул (микросфер) диаметром 5, 6 мкм каждый вид микросфер имеет уникальную спектральную характеристику (за счет комбинации внутренних красителей красного и инфракрасного спектра), что позволяет использовать до 100 различных микросфер в одном исследовании (мультиплексный анализ )
Технология x. MAP (Multiple Analytes Profiling) поверхность микросфер одного типа покрыта одним видом специфического антигена T. pallidum при добавлении исследуемого образца к суспензии микросфер антитела связывается с соответствующей микросферой внесение детектирующего агента (конъюгаты, содержащие флуоресцентную метку)
Технология x. MAP (Multiple Analytes Profiling) детекция результатов x. MAP Проточная система 2 типа лазеров возбуждают флуоресцентные красители красный лазер - для классификации типа микросфер зелёный лазер - для получения зелёный лазер количественного результата исследования
Технология x. MAP (Multiple Analytes Profiling) Оборудование для x. MAP Bio. Plex 200 (Bio-Rad) Bio. Plex 2200 (Bio-Rad) Luminex 100 (Luminex) Наборы реагентов для x. MAP (для исследовательских целей) The Bio. Plex™ 2200 Syphilis Ig. G kit (Тр15, Тр17 и Тр47) позволяет получать результаты раздельного определения антител класса G The Bio. Plex™ 2200 Syphilis Ig. M kit (Тр15 и Тр47) позволяет получать результаты суммарного и раздельного определения Ig. M
Технология исследования в формате микрочипа на микроскопных слайдах Иммуночип – это современная технология, используемая в молекулярной биологии и медицине иммуночип - небольшой участок поверхности твердого носителя, на котором с большой плотностью в определенном порядке нанесены антигены T. pallidum) Иммуночип, разработанный в ФГБУ . . . К- К- (4) К+ К+ Tp 17 Tp 41 Tp 44. 5 Tp 47 Tp 15 Tp 42 КЛ КЛ (21) К- К- (24) «ГНЦДК» Минздрава России представляет собою микроскопный слайд, поверхность которого разделена на 12 одинаковых участков – эрреев , каждый содержит комплекс наиболее специфичных и иммуногенных антигенов T. pallidum
Технология исследования в формате микрочипа на микроскопных слайдах монтаж микроскопных слайдов в кассете-держателе
Технология исследования в формате микрочипа на микроскопных слайдах внесение в лунки образцов биологического материала
Технология исследования в формате микрочипа на микроскопных слайдах удаление реагентов из лунок на микроскопном слайде
Технология исследования в формате микрочипа на микроскопных слайдах) учет результатов исследования на спектрофотометрическом ридере
Технология исследования в формате микрочипа на микроскопных слайдах) представление результатов исследования и их интерпретация
Технология исследования в формате микрочипа в лунках иммунологического планшета на предприятии ЗАО «ЭКОлаб» разработана технология исследования в формате иммуночипа, при которой иммуночипа рекомбинантные антигены бледной трепонемы наносят на дно полистиролового иммунологического планшета; особенностью исследования является использование для выявления на твердой фазе (иммуносорбенте) формирующихся иммунных комплексов по технологии ФОСФАН, при которой регистрируется иммунофосфоресфенция; особенностью технологии является возможность длительного сохранения результатов исследования и повторного снятия показателей с носителя.
Технология исследования в формате микрочипа на микроскопных слайдах) исследование на иммуночипах позволяет определять присутствие антител разных классов дифференцировано к разным антигенам T. pallidum; требуется небольшое количество образца биологического материала (10 -50 мкл); общая длительность исследования не превышает 2, 5 часов; результат оценивается по двум параметрам: качественный - специфические антитела определены или нет; полуколичественный - по интенсивности сигнала возбужденной люминесценции или фосфоресценции.
Показания к применению ТТ Трепонемные тесты проведение скрининга на сифилис (ИФА, РПГА, ИХЛА, ИХр. А), в особенности в популяциях с низкой превалентностью сифилиса; у лиц с соматической патологией, имеющих положительные результаты в НТТ, результаты исследования в ТТ позволяют выявить ложные положительные результаты серологического обследования в НТТ; подтверждение положительных результатов, полученных при скрининге с использованием таких высокочувствительных и высокоспецифичных ТТ как: ИФА, РПГА, ИХр. А, РИФabc/200, РИБТ и ИБ.
Алгоритм обследования с целью выявления активного течения сифилиса Скрининг населения с целью выявления сифилиса с применением НТТ (РМП, RPR и их аналоги) Положительный результат Отрицательный результат По клиническим показаниям Окончание обследования Трепонемный тест (ИФА, РПГА, ИХЛ, РИФ, РИТ) Положительный результат Клиническое обследование для установления клинической формы активного сифилиса Отрицательный результат БЛПР, обследование целью выявления причин
Рекомендации по применению Тестированию c целью скрининга на сифилис с помощью данного алгоритма подлежат: лица в период общего диспансерного медицинского наблюдения; пациенты при госпитализации в медицинские учреждения; лица, в прошлом перенесшие сифилис и состоящие под клинико-серологическим наблюдением (с сохраняющимися положительными результатами исследований крови на сифилис в трепонемных тестах).
Реверсивный алгоритм обследования на сифилис Скрининг населения с целью выявления сифилиса с применением ТТ (ИФА, РПГА, ИХГ, ИХЛ) Положительный результат Отрицательный результат По клиническим показаниям Окончание обследования Нетрепонемный тест (РМП, RPR, VDRL) Положительный результат Клиническое обследование для установления диагноза (клинической формы активного сифилиса) Отрицательный результат уточнение анамнеза: - перенесенный сифилис Продолжение обследования: - ранний сифилис - ложная позитивность
Рекомендации по применению Тестированию c целью скрининга на сифилис с помощью данного алгоритма подлежат: лица, изъявившие желание стать донорами; пациенты при госпитализации в медицинские учреждения; пациенты кожно-венерологических учреждений с подозрением на ранний сифилис, в том числе с отрицательными результатами обследования прямыми тестами (ТМП, ПЦР); лица, в прошлом перенесшие сифилис и состоящие под клинико-серологическим наблюдением (с сохраняющимися положительными результатами иммунологических исследований крови на сифилис).
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА, ПРИМЕНЯЕМЫЕ 2013 год В ДВУ (РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ) 93% 80% 88% 32% 95% 39% 63% 19% 5% 5% Доля лабораторий, применяющих диагностический метод
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА, ПРИМЕНЯЕМЫЕ 2013 год В ДВУ (РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ) РИФ-1, 5% ИБ-0, 007% РПГА-11, 1% РИТ-0, 09% ПЦР-0, 004% ИФА-23, 7% РМП-42, 4% РСК-15, 6% RPR-5, 4% Доля исследований каждым методом в общей структуре выполняемых исследований
Трепонемные и нетрепонемные тесты Перспектива развития трепонемных и нетрепонемных тестов для лабораторной диагностики сифилиса в мире и в Российской Федерации
перспективные направления исследований Control иммунохроматографический тест для одновременно определения антител к трепонемоспецифическим антигенам и кардиолипину 1 2
перспективные направления исследований иммунохроматографический тест для одновременно определения антител к трепонемоспецифическим антигенам и кардиолипину Control Line Treponemal Non-Reactive Cardiolipin Reactive BFP Treponemal Pos Cardiolipin Pos Treponemal Neg Cardiolipin Pos Reactive Treponemal Pos Cardiolipin Neg
перспективные направления исследований отечественные производители продолжают разработки и регистрацию с целью производства в России новых наборов реагентов для диагностики сифилиса; разработаны технологии выявления трепонемоспецифических антител класса M и G в ИБ в РИФабс
Проблемы диагностики сифилитической инфекции Динамика антителообразования при сифилисе Титры Антител РИФ-абс ИФАIg. M 19 SIg. M-FTAabs 1 2 3 4 5 Ig. M (ИФА-Ig. M, РИФ, иммуноблоттинг) 6 7 8 9 недель Сифилис I Инкубационный период Серонегатив- Серопозитивный ый 1 2 3 Сифилис II Ig. G (ИФА, РПГА, РИТ, РИФ) 4 10 20 30 40 Сифилис III лет
Проблемы диагностики сифилитической инфекции Ошибки в выполнении исследования связаны с нарушениями, допускаемыми на преаналитическом (50 -70%), аналитическом (10 -15%) и постаналитическом (1525%) этапах исследования Ложноположительные и ложноотрицательные результаты, как правило, связаны с низким качеством применяемых диагностикумов, их невысокой чувствительностью и специфичностью, но могут быть обусловлены и другими «серологическими» причинами Несовпадение результатов исследований образца в разных диагностических тестах и в разных лабораториях
«Серологические» причины расхождения результатов исследований в разных реакциях: расхождение результатов объясняются особенностями синтеза антител различных классов на различных этапах развития инфекционного процесса; ввиду разного состава используемых в тесте антигенов (цельная клетка T. pallidum, ультраозвученный трепонемный антиген, химерные полипептиды – аналоги антигенов T. pallidum) разная природа исследуемых антигенов (в РИФ - антитела к антигенам полисахаридной природы, в реакциях с кардиолипиновым антигеном – антифосфолипидные иммуноглобулины, в ИФА - антитела к антигенам белковой природы) избыток антител в сыворотке крови больного, что обусловливает конкуренцию антител с разной валентностью за сайты связывания с антигеном и блокаду антигенных детерминант, что проявляется «феном прозоны» нарушение иммунного ответа у больных ВИЧ недостаточная (различная) чувствительность наборов реагентов или диагностикумов
Пути решения «серологических» причин расхождения результатов лабораторных исследований комплексное использование серологических НТТ и ТТ тестов с разным принципом выявления антител проведение полуколичественной оценки содержания реагиновых антител путем последовательного разведения образца, показавшего любую степень позитивности применение в качестве подтверждающих тестов других трепонемных методов исследования, основанных на определении иного типа антител, другого метода их идентификации или дифференцированного определения антител к разным антигенным детерминантам тщательный сбор анамнеза и учет результатов обследования на наличие других инфекционных заболеваний, таких как ВИЧ и вирусные гепатиты человека применение тестов с более высокой чувствительностью
Основные направления развития лабораторной диагностики сифилиса автоматизация процесса диагностического исследования объективизация учета результатов исследований применение технологий архивирования результатов исследования
Нормативная база лабораторной диагностики сифилиса источники: сайт Министерства здравоохранения РФ; информационные банки Консультант. Плюс, Гарант и другие источники: сайт ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России www. cnikvi. ru сайт РОДВК www. rodvk. ru
Методическая литература для лабораторной диагностики сифилиса источники: сайты производителей диагностических наборов реагентов ЗАО ЭКОлаб www. ecolab. ru
Заключение специалисты КЛД и дерматовенерологи имеют в своем арсенале богатый выбор методик и разрешенных к применению наборов реагентов для выявления в образцах крови пациентов специфических Ab к Ag возбудителя сифилиса, в том числе: - суммарно Ab всех классов; - дифференцированно класса М или G; - дифференцированно к наиболее специфичным Ag; разработаны алгоритмы обследования населения для выявления больных сифилисом, основанные на применении на начальном этапе как НТТ , так и ТТ; разработки и предложения современных лабораторных тестов зачастую опережают клиническую оценку результатов для определения отдельных показателей здоровья пациентов.
Спасибо за внимание! ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Минздрава России ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н. И. Пирогова» Минздрава России Вопросы? контакты по электронному адресу: svrotanov@mail. ru
Скачать презентацию ЭЛЕКТИВЫ ГБОУ ВПО РНИМУ им Н И Пирогова
+1_2015 Осн_Лаб диагн сиф_Ротанов СВ.pptx